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        trizolRNA提取的具体步骤有哪些?

        相关实验:TRIzol RNA 提取方法

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        我贱故我在

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        3 个回答

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        称取组织约50mg置于2mLEP管中,剪碎;加入Trizol试剂1mL,匀浆器研磨成浆,移入新的1.5mL EP管中,吹打混匀,室温静置5min;加入200μL氯仿,剧烈振荡混匀,冰上静置5min,4℃ 15000g离心15min;吸取上层透明液体至新开启1.5mL EP管,加入500μL异丙醇,轻轻上下颠倒两次混匀,-20℃冰箱静置30min,4℃ 15000g离心15min;加入200μL 75%乙醇洗涤沉淀两次,4℃ 15000g离心15min;弃上清,将EP管倒扣于洁净吸水纸上,室温晾干,加入适量DEPC水溶解沉淀,轻轻振荡混匀,置于冰上待用。

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        府宅

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        1)取一定量的纯化过的孢子悬浮液,12000rpm ,离心5min,弃上清

        a 或者用匀浆仪进行匀浆处理,悬浮液不经离心,直接加0.5ml Trizol reagent于冰上充分匀浆悬浮液样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.,然后再加入0.5ml Trizol 冲洗匀浆器,转移至1.5ml EP管中

        b 直接在悬浮液中加入Trizol裂解细胞,加1ml Trizol.用取样器吹打几次

        2)1ml Trizol Reagent,震荡混匀

        3)将匀浆样品在15-30℃放置5mim,使得核酸蛋白复合物完全分离。

        4)可选步骤:4 ℃ 12 000rpm离心10min,取上清。

        5)每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿,盖好管盖,在漩涡振荡器上震荡15s,室温放置3min。如不能涡旋混匀,可手动颠倒混匀2min代替。

        6)4 ℃ 12 000rpm,离心10-15min,样品会分成三层:红色的有机相,中间层和上层无色的水相,RNA主要在水相中,把水相(约600ul,约为所用Trizol试剂的60%)转移到新管中。

        7)在得到的水相溶液中加入等体积(500ul)的异丙醇,上下颠倒混匀,-20℃ 放置20-30min。

        (植物或动物组织RNA提取中,容易沉淀出大量的蛋白等污染物,导致电泳检测时看不到RNA。可以按以下步骤操作减轻污染:在上清中加入1/2体积的异丙醇,1/2体积的RNA助沉剂,然后进行以下操作。)

        8)4 ℃ 12 000rpm离心10min,去上清。

        (离心前RNA沉淀经常是看不见的,离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。)

        9)加入1ml 75%乙醇(DEPC水处理过的水配制)洗涤沉淀。加入后把管子敲一敲,尽量使RNA沉淀飘起来,每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。有时,为避免RNA被洗掉,此步可以省掉,洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇,但是不能过于干燥,否则不易溶解。

        10)4 ℃ 12 000rpm离心5min,弃上清;短暂快速离心,用移液器小心吸弃上清,注意不要吸弃沉淀。

        11)室温放置晾干(晾干2-3min左右即可)。加入适量DEPC水或0.5%SDS,用枪头吸打几次,充分溶解RNA。50度保温1小时。如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅ 的去离子甲酰胺。溶解,-70℃保存。可以分装保存,防止污染,

        12)取1ul+1ul buffer 电泳检测RNA完整性,稀释一定倍数,分光光度计测定纯度和浓度。

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        dxy_gwrp7ndq

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        1、组织匀浆

        (1) 取出高温高压消毒后研钵,切取50-100mg冰冻组织置于研钵内,倒入液氮,研碎。

        (2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL,标本的量不能超过TRIZOL体积的10%,否则会出现DNA污染。

        (3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中,在15- 30°C放置5分钟,以彻底分离核蛋白复合体。

        2、相分离

        加入0.2 ml的氯仿,加盖好后用手剧烈摇晃15秒,在15- 30°C放置2-3分钟,然后离心 12,000× g,15 minutes , 2 - 8°C。离心后分成三层,下面的红色为酚-氯仿相,一个中间层,一面是无色的水相。RNA只存在于水相中。水相占总TRIZOL的60%。

        3、RNA沉淀

        将上层水相转移到另一干净的EP管中, 加入0.5ml异丙醇,静置10 minutes ,15 -30°C,然后离心12,000 × g ,10 minutes, 2 - 8°C。离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀,这就是RNA沉淀。

        4、RNA洗涤

        去上清, 加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀,振荡器混匀,离心7,500 × g ,5 minutes,2 -8°C。

        5、RNA再溶解

        去上清,置真空或空气中5-10分钟,干燥RNA沉淀,(不能在真空中离心干燥)。注意不能将RNA沉淀完全干燥,这样会极大地降低它的溶解度。部份溶解的RNA样品其A260/280 ratio < 1.6。

        用无RNase 水或0.5% SDS溶液重悬RNA沉淀,用枪头反复吹打几次,静置10分钟,55-60°C。测浓度后-20°C保存。

        6、测浓度

        7、RNA鉴定

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