实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问WB封闭时，什么时候用脱脂牛奶，什么时候用BSA？

府宅

做磷酸化蛋白一般不用脱脂奶，因为脱脂奶中有磷酸化蛋白，会使背景加深。其他时候一般BSA和脱脂奶通用就好了根据经验来说，如果strip液洗过的，用脱脂奶感觉封闭的好一点

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问SDS-PAGE电泳怎么区别loading buffer质量好坏？以及电泳的注意事项？

whilt-shirt

Loading buffer即常用的电泳上样缓冲液，工作浓度是1X 。Loading buffer中的还原剂如DTT、beta巯基乙醇可以打开蛋白的二硫键、使之解聚为亚基；还可与蛋白结合使之沉于孔底，易于电泳；同时还有指示作用。一般选用好的公司生产的Loding Buffer。电泳结束后，应及时冲洗电泳槽,以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀。清洗电泳芯时，一定要注意别弄段电泳丝。

3 回答2974 围观

问转染后出现细胞死亡是什么原因造成的？怎么才能优化？

协和再爱我一次

转染试剂有毒性，加的量需要斟酌，最好问过师兄师姐。或者换用毒性更小的温和一点的转染试剂

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问RNA提取相关的问题

whilt-shirt

1.一定要注意冰上操作,低温离心。2.戴口罩和勤换手套,去任何东西都要带着手套去取。3.每次去器材的时候都要用镊子去夹,镊子要在酒精灯上烧一下。4.所有的器材都要经过 DEPC 浸泡后高压后才可以使用,所需要的氯仿,酒精, 异丙醇等都保证没有被 RNA 酶污染,不能用没有泡过 DEPC 的枪头去提取液体。

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问提取DNA前处理有磁珠，一般会是哪里的原因？

丁香粉猪猪

可能跟磁珠的词性跟或者磁吸的时间有关

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问WB最后显影的结果有非特异性条带，而且比目标条带颜色更深，怎么解决？

whilt-shirt

可以换用NC膜，减少蛋白吸附，降低背景；封闭时间可以延长，过夜；一抗时间缩短，室温2个小时即可；降低上样量和加大一抗稀释度；延长冲洗时间和次数。如果没有好的BSA就换为牛奶封闭试一下，效果可能好一点。

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问小片段RNA干扰致基因表达沉默的具体步骤有哪些？

Kimser

1，制备sirna，有化学合成法和转录法，其中还涉及shrna和Ago蛋白2，转染宿主细胞3，检测靶基因是否沉默

3 回答1056 围观

问加入考马斯蓝试剂后需要在多长时间内测完？样品太多，放置时长太长会不会有影响？

Kimser

2分钟内就可以和蛋白质结合，能稳定存在1h。放置时间没有确切时间，不过要4℃保存，再用记得复温

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问结果出现了非特异性着色的问题，是实验的哪一步出了问题，需要怎么改进？

菲菲飞呀飞

1.非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果2.缩短 DAB 孵育时间或降低 DAB 浓度/过氧化氢浓度等；3.适当增加 PBS 冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或 SP 孵育之后的浸洗尤为重要；4.防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色

3 回答184 围观

问DAB-H2O2 显色的时间过长了，显示的结果不太好，有什么补救方法吗？

煤球儿啊

重做一次比较好，新片子重做比较好

3 回答605 围观

问动物组织如何提取高纯度rna

丁香粉猪猪

RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取动物RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行。可使用RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑

4 回答635 围观

问组织切片脱蜡水化时使用的乙醇梯度设置几个比较好？时长控制在多长时间？是越长越好吗？

whilt-shirt

1)水洗后组织于5ml离心管内2) 75%乙醇脱水1 h-2 h或过夜（此步骤可根据实验时间安排选择是否过夜)3)80%乙醇脱水1 h-2 h4)90%乙醇脱水1 h5)95%乙醇脱水0.5 h或者过夜(此步可过夜组织仅限于肝，脑，肌肉等含水量多的组织)6)无水乙醇脱水20 min两次(依据含水量多少，脱水20-60min)7)无水乙醇+二甲苯1:1 20min。(进行过渡，以防脱水不彻底)

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问蛋白质测序结果多次失败，怎么提高实验的成功率？

whilt-shirt

在目前条件下，质谱很难100%给出肽段的序列，经常会丢失一些肽段，蛋白质磷酸化修饰也会抑制胰蛋白酶的酶解，并且磷酸化肽的含量较非磷酸化肽段的含量少很多，质谱对质谱分析仪磷酸化肽的响应就可能会被抑制。因此，要尽可能把非磷酸化肽段的含量降到。减少非磷酸化肽的方法有分馏、IMAC（固相化金属亲和色谱）和抗体结合。通过MALDI-TOF-MS测定肽段的分子量，根据所得肽段分子量比预计的分子量大80Da或其

1 回答571 围观

问预防蛋白质样本变性方面有什么需要注意的地方？

whilt-shirt

环境可以影响蛋白质，如温度、重力等因素都会使蛋白质变性，保持低温和适当的酸碱度，给其温和环境

3 回答563 围观

问新手想做这个试验，大概要花费多少时间成本跟金钱成本呢？

煤球儿啊

新手啥都不会的话，需要摸索的东西就比较多，费时费力

3 回答377 围观

问在做DNA印记之前需要哪些试剂来处理genomic DNA?

whilt-shirt

1 酸变性液:0.25mol/L HCl，用分析纯的盐酸12Mol/L稀释 2 碱变性液,0.5mol/L NaOH，1.5mol/l NaCl pH13.1 3 中和液，0.5mol/L Tris·HCl(pH7.5),1.5mol/L NaCl 4 20×SSC: 0.3mol/柠檬酸，3mol/L NaCl,pH7.0 5 10×SSC和2×SSC 用双蒸馏水稀释20×SSC储存液

4 回答443 围观

问转染效率问题！！！

dxyv9281

应该先做REALtimePCR检测一下，如果确定低了，然后再做蛋白水平的检测

3 回答554 围观

问含脂肪较多的样品如何提高RNA质量？

guoyanli0000

氯仿反复抽提，离心后分离可得到高RNA质量

5 回答503 围观

问临床手术取到的肿瘤组织如何保存使得RNA最不容易降解？同时也能提蛋白？

协和再爱我一次

要么超低温冻存要么加好Trozol研磨后冻于-80，用于后期提取RNA直接加裂解液研磨后冻于-40以下冷冻，用于后期提蛋白以上均不可反复冻融

3 回答367 围观

问出现蛋白没有活性什么原因？

dxyjonas

蛋白质在抽提时，许多试剂都会改变蛋白质的空间结构，如二太多键的断裂，些金属离子的析出，以及各种次级键的重新组合都会影响蛋白质的功能。

2 回答532 围观

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