实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问western提取出来的蛋白质保存方法？

府宅

蛋白样品放到-80℃也并不完全保险，虽然能存放久一些，但是最好不要冻融超过两次。蛋白浓度测定后，可以加入loading buffer 煮样，煮后可根据实验需要分装成小管，下次实验前拿出小管再次煮样即可。

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问提高电泳分辨率的途径有哪些？

bqejjh123

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高电泳的分辨率。

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问westernblot加样的顺序是什么？

dxy_gwrp7ndq

上样顺序一般是让与抗体有反应的样品和没有反应的样品间隔开，这样条带之间反差比较明显。

4 回答2077 围观

问WB中内参的意义是什么？

dxy_gwrp7ndq

1. 是看提取蛋白质量的好坏。如果做western的时候，内参照蛋白有条带，而目的蛋白没有，说明蛋白的提取和转膜等步骤没有问题，是目的蛋白的抗体质量不好或者是稀释倍数不对。2. 是比较客观的说明目的蛋白的表达情况，消除上样量等的误差。不同的标本之间由于蛋白提取的量有差别，可能强阳性的表达跑出来的带很弱。因此设立内参照，比较不同标本之间的表达情况。

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问WB中BCA法标准曲线怎么做？

邓豆豆逗

找一个已知准确浓度的蛋白（一般试剂盒的话里面是有的），自己也可以用bsa配，然后稀释一个浓度梯度，比如2，1.5，1，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1，0ug/ul，然后每个样至少三个复孔，做出来的od值和浓度做一个散点图，添加趋势线得到公式，然后再将样本的od值带入公式求得浓度就行了

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问免疫组化时染色比较弱拍图不好看怎么调整？

dxywode

小心处理组织样本，尽量保持组织细胞结构的完整性。如果组织的穿透力差，则要制备较薄的切片。调整好固定液的理想pH、固定时间和温度。可考虑用单抗（不是多抗），避免交叉反应。如果非特异性结合太强，则适当减少抗体的孵育时间。

3 回答1031 围观

问做WB曝光后目的蛋白位置出现2个相邻条带，但是抗体说明书上没有提过会有2条带情况，原因可能是什么呢？

邓豆豆逗

可以先看一下抗体官网的一些效果图，是否做出来有两条带的现象，其次查一下相关文献，看这个蛋白是否有剪切体或一些修饰之类的，还有可能是蛋白降解了，这时候可以找一个阳性对照一起做，如果阳性对照是单条带，就考虑是样本的原因了

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问怎样提高WB实验蛋白定量与上样量的效率及准确性？

bamboopiggy

这个，只能说勤能补拙，多做，经验丰富了就好了。一般情况下，在做标曲的时候，加样要准确，标曲出来的R^2值，接近0.99最好。样品稀释时，枪尖要和枪match，吸液时，枪尖别下的太深。上样时，同样注意枪尖和枪的match程度，以及枪的准确性。

4 回答717 围观

问蛋白质的等电点是否与蛋白质的质量有关？

天一湖医者

蛋白质是两性电解质，其等电点和它所含的酸性氨基酸和碱性氨基酸的数量比例有关。各种蛋白质因氨基酸残基组成不同，等电点也不一样。

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问磷酸化的抗体为什么总是杂不好

bamboopiggy

我牛奶和bsa都用过，这个其实是要看你的抗体好不好用，如果抗体好用，怎么杂怎么出。如果抗体不好用，一般都杂不好。此外，可以考虑在收样的lysis里面加点磷酸酶抑制剂。实在杂的难看，就换家公司买抗体，磷酸化的抗体，一般cst的还是不错的。

4 回答450 围观

问请问梯度胶好用吗？可以同时收集到20kDa和150kDa分子量的蛋白吗？

dxy_gwrp7ndq

使用梯度胶，小分子量蛋白运动至在胶浓度更高的底部（正极），同时大分子量蛋白在顶部有更好的分离。如下图：选择最佳的丙烯酰胺凝胶浓度达到高效的蛋白分离

4 回答480 围观

问纯化后的蛋白质怎样保存？

dxy_gwrp7ndq

1. 低温低温下保存蛋白质是极其必要的。低温意味着更低的能量，低温下蛋白质分子热运动较低，其内部的成键不容易断裂。另外，在低温下，微生物不容易生长，可能存在的蛋白酶的活性也会很低，这些更容易保证蛋白质的活性。2. 分装蛋白质有时候是需要冷冻保存的，但我们使用蛋白质时却是在室温或者更高的温度。冻融这一过程会对蛋白质造成不可逆的损伤。因此我们需要尽量减少冻融的次数。纯化后的蛋白质，进行分装保存，每次需

4 回答3888 围观

问如何避免蛋白质谱实验中的二次污染问题

府宅

在质谱分析中，最常见的蛋白质污染物包括角蛋白和血清白蛋白。其他质谱（MS）蛋白污染物还包括酪蛋白和大肠杆菌蛋白质。在实验中，可以通过以下方法避免将上述蛋白质污染物引入样品：1. 保持实验室清洁、减少灰尘和空气流动；2. 使用一次性过滤吸头；3. 定期清洗电泳、染色、微量离心机等设备，避免通过接触或气溶胶引入污染物颗粒；4. 穿戴洁净的实验服和手套。

4 回答1393 围观

问蛋白纯化实验前需要先做好哪些准备？

dxy_gwrp7ndq

对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料

3 回答890 围观

问MTT实验时怎样避免血清干扰的问题？

bamboopiggy

血清不会影响mtt的结果啊，因为你加完mtt以后，要吸出，然后加dmso溶解甲臢，不存在血清影响的问题。如果你用cck8也没事，会对cck8造成影响的是氧化剂，不是血清。

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问怎样有效减少His标签蛋白纯化效果不理想的问题？

迟C迟

1、His标签在中性或碱性条件（pH7~8）下，与Ni2+有更强的结合力，与Tris-HCl缓冲液相比，在磷酸缓冲液中His标签表现出与Ni2+更强的结合力。2、HisTrap HP和HisTrap FF的蛋白结合载量都是至少40mg (His) 6重组蛋白。大家可以根据填料的结合载量选择预装柱和填料的规格。3、如果目标蛋白中的咪唑需要去除，可以根据样品体积选择适合的上机脱盐柱（HiTrap De

5 回答1051 围观

问凝胶过滤层析过程中发现分辨率不高的常见原因有哪些？

府宅

1.加样要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组分分子量差异较大，加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％－5％左右，而分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶柱床体积的10％－25

4 回答1797 围观

问Strep tag(strep标签)有哪些特点？

天一湖医者

1.适合从真核或原核表达体系中纯化strep 标签蛋白2. Strep-Tag II 为8 个氨基酸（W-S-H-P-Q-F-E-K），不会影响标签蛋白的功能结构。3. Strep-tag 可以和His 标签蛋白联合使用，进行两步纯化获得超高纯度蛋白。

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问Rt-pcr怎么样提高cDNA 的合成产量？

府宅

1.PCR反应体系的组成，如酶离子的浓度等也会显著影响；2.PCR条件，如引物的退火温度选择对提高PCR试验的灵敏度和产量也非常关键；3.如果PCR产量较低的话，你也可以通过二次PCR来提高产量，即把第一次的PCR产物适当稀释，再以它作为模班进行PCR，同时你也可以通过TOUCH-DOWN PCR来提高PCR的特异性和产量。

7 回答762 围观

问miRNA相关试验如何开展呢？

dxywode

3 回答467 围观

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