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实验问答

28,295,473 科研人在看

问ChIP实验中最关键的结果是什么？什么样的富集倍数被认为是阳性的结果？

whilt-shirt

染色质免疫共沉淀（ChIP）实验本身其实就是一个通过免疫沉淀反应验证蛋白与DNA相互作用的实验。因此结果一般包括两个数据：免疫沉淀的效率（富集效率）, 蛋白与DNA结合能力（富集倍数）。但是这两个结果本身都是一个相对值，因为富集效率就是断裂后的染色质分成两部分，一部分进行免疫沉淀，一部分作为对照不进行免疫沉淀，然后两者进行比较，得到一个百分比。富集倍数就是取两个抗体进行免疫沉淀，一个是特异性的抗体

1 回答927 围观

问蛋白为什么要冻干？冻干对蛋白的影响有哪些？

bamboopiggy

冻干蛋白好保存，且不容易变性。冻干是物理干燥，不会影响蛋白功能。

3 回答1211 围观

问曝出来的目的条带位置不对，预测位置在34，结果只有55有条带，而且很明显，为什么？

whilt-shirt

可能是杂带，建议更换新的抗体试试

3 回答414 围观

问去年在学校做的，好几次都没有结果，而且还很脏。

dxy_gwrp7ndq

二抗孵育的时间不宜过长，一般是室温下摇床孵育1~2小时，抗体孵育完成后要清洗干净，特别是二抗孵育完成后，否则可能导致显影结果出现高背景。

3 回答444 围观

问10%的胶，恒压80V跑浓缩胶，120V跑分离胶，120V转膜2小时

sing生物狗

其实这个是胶的原因可能性大，建议充分混匀，跑的电压应该没问题的

3 回答779 围观

问qPCR实验中Ct值是什么意思？有什么作用？怎么看？

天一湖医者

阈值循环数 Threshold cycle (Ct) 也写作Cq值，荧光信号大于荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线（baseline），是由于测量的偶然误差引起的。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节。高于阈值的荧光信号被认为是真实的信号，用于定义Ct值。Ct会受到阈值的影响，每次试验由于样品和仪器的不同会导致基线不

3 回答2579 围观

问测定蛋白质含量用考马斯亮蓝法更好些还是酚试剂法更好些？为什么？

bamboopiggy

两个方法都可以，但是酚试剂步骤更简单一些。

3 回答1131 围观

问IP后WB鉴定到目的蛋白，为什么质谱未鉴定到

天一湖医者

一般复杂样本中蛋白种类非常多，质谱检测并不能将所有蛋白质全部鉴定到，有些丰度含量较低的蛋白在质谱结果中不一定能够完整体现；Elisa/WB相比与质谱来说灵敏度不同，前者具有放大效应，抗体会对目标蛋白有一个富集效应，所以只要选对抗体，感兴趣的蛋白基本都会被检测到；而质谱结果中，如果目标蛋白丰度较低，在组学中未检测到也是正常的，质谱检测的后期验证建议用PRM。

2 回答2322 围观

问选了β-tubulin做内参，老是有非特异条带，还整整齐齐的，有什么办法解决呢？

whilt-shirt

一般这种情况要不更换新的抗体，要不降低抗体浓度

4 回答828 围观

问跑western条带总是中间浅、两侧深的原因是什么？

whilt-shirt

是不是转膜没夹紧导致的，尝试更换新的转膜滤纸

3 回答3084 围观

问bca定量总蛋白一致内参tubulin不一致

邓豆豆逗

更换内参再试试，如果差异还是很大，说明定量结果不准，只能根据条带亮度进行上样量的调整了。（bca定量结果只能作为参考，不能作为你内参一致的依据）

6 回答1456 围观

问wb中配置Running buffer和wet buffer时怎么选择SDS的浓度？

毛桃子啊

1.电泳缓冲液（Tris-Glycine/SDS）25mM Tris base190mM 甘氨酸0.1% SDS测定 pH 值并将 pH 值调整至 8.32.转膜缓冲液（湿转）25mM Tris base 190mM 甘氨酸20% 甲醇测定 pH 值并将 pH 值调整至 8.3对于大于 80 kDa 的蛋白，建议 SDS 终浓度为 0.1%。3.转膜缓冲液（半干转）48mM Tris base39

3 回答1537 围观

问western blot实验条带颜色整体都很深，是什么原因造成的？做完了还能再改进么？

邓豆豆逗

可能原因有很多，你可以逐个排查:1.封闭时间不够或封闭液不行，建议用5%脱脂奶粉封闭，封闭时间至少1h；2.洗液被污染或一抗和二抗洗涤不充分，建议更换新鲜洗液，同时延长洗涤时间和次数，比如增加到5次，每次5mim；3.ecl发光液是超敏ecl，可以用tbst稀释一下或者用普通ecl曝光；4.pvdf膜被污染，操作过程中一定不能用手碰到膜，很容易粘上脏东西被污染；5.如果是组织提取蛋白做实验的话，可

7 回答2713 围观

问Co-IP实验中使用的对照抗体有哪些？

天一湖医者

鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。

2 回答971 围观

问如何确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是细胞的溶解

bamboopiggy

采用免疫荧光共定位相互作用的蛋白，看荧光的位置。

3 回答477 围观

问大分子蛋白总转不出来，该如何调节电泳条件?

dxy_a3w222q8

大蛋白先试试marker能转上吗，如果能应该没问题，如果不能适当在此基础上延长转膜时间；蛋白的上样量也可以加大吧，可以试试。

6 回答1485 围观

问双向凝胶电泳为什么能一次性分离上千种蛋白质？

bamboopiggy

因为双向电泳一个方向分辨出不同分子量的蛋白,另外一个方向是同样分子量的蛋白，有不同的电荷，按照电荷的多少，再将同样分子量的蛋白细分，所以能从电荷和分子量两个方面来区分蛋白。

3 回答728 围观

问CO-IP实验怎么区别是两种蛋白直接结合还是有其他蛋白辅助相互作用？

邓豆豆逗

Co-IP只能证明两种蛋白有相互作用，无法说明是直接还是简介的，如果想知道是直接还是间接的，可以做GST pull-down实验。

3 回答1170 围观

问CO-IP实验如何确定蛋白相互作用是发生在细胞中的，而不是由于细胞破裂溶解释放蛋白产生了互作？

lyang556

细胞裂解时采用温和的裂解条件，应采用非离子变性剂（如：NP40），这样能够不破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用。要想明确蛋白间的相互作用是细胞中发生还是细胞的溶解才发生需要进行蛋白质定位。

3 回答383 围观

问蛋白结构探索，什么是蛋白

小布丁瑶瑶

蛋白质结构是指蛋白质分子的空间结构。作为一类重要的生物大分子，蛋白质主要由碳、氢、氧、氮、硫等化学元素组成。所有蛋白质都是由20种不同的L型α氨基酸连接形成的多聚体，在形成蛋白质后，这些氨基酸又被称为残基。蛋白质和多肽之间的界限并不是很清晰，有人基于发挥功能性作用的结构域所需的残基数认为，若残基数少于40，就称之为多肽或肽。要发挥生物学功能，蛋白质需要正确折叠为一个特定构型，主要是通过大量的非共价

3 回答608 围观

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