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问
提出来的蛋白浓度太低,比如低于1ug/ul,有什么办法提高蛋白浓度吗?
天一湖医者
1、增加细胞量,比如两瓶细胞一起提蛋白。2、减少裂解液用量,比如200ul,浓度可能会加倍。3、延长裂解时间。4、改变方法:
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问
跑通路蛋白 总蛋白和磷酸化蛋白都升高可以说是激活了吗? 跑的AKT和ERK两个位点都是
dxywode
western主要检测信号系统中的蛋白磷酸化水平,如果磷酸化水平升高则说明蛋白激活了。另外还有检测NF-kB和DNA的结合水平,主要采用EMSA,和报告基因的方法。检测TNF,IL,iNOS,COX-2的mRNA表达(RT-PCR)。检测IkB的磷酸化,泛素化和降解(IP,Western)。
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问
怎么让跑出的胶条带比较整齐,不歪歪扭扭?
天一湖医者
可以更换缓冲液!还有就是上样品时样品漂了。
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问
在SDS-PAGE胶跑完之后,为什么要再用考马斯亮蓝染色呢?我们看染色出来的胶是看条带整体颜色均一还是某些条带的粗细一致呢?
bamboopiggy
跑完page胶。如果没有转膜直接考染,就是看蛋白的表达,看条带的粗细,如果是转膜后考染的话,就是看蛋白是否转过去了
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问
为什么有的时候跑不出条带,然后背景还很糊?
迟C迟
背景模糊可能有以下几个原因:1. 没有封闭好,可能很大2. 一抗浓度太高,适当降低增加一抗稀释比例,你最好先做个titration,确定一个最佳的抗体稀释比例3. 二抗孵育时间太长,一般室温45min,二抗切不可孵育时间太长没有目的条带是主要问题,检查样品蛋白和抗体。
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问
请教一下,准备做coIP,抗体选择原则是什么?
迟C迟
直接登陆Thermo Fisher Scientific 官网的抗体主页:www.thermofisher.com/antibodies ,选择具体的实验应用(Application),例如WB/IF/IHC/ICC/ELISA/FACS等Tip:不同的实验对抗体的要求是不同的,一种抗体也有可能适用于多种用途。例如适用于Western Blot(WB)的抗体多数也适用于Dot blot、免疫组化(
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问
怎么保存可以延长一抗的使用时间?
dxywode
工作液根据需要稀释在5%奶粉里,再加入少量叠氮化钠(大约0.01% w/v),4度保存。Alisa_lin(站内联系TA)分装,-20度保存。不要反复冻融,没有用过粉末的二抗,按说明书呗石头2011(站内联系TA)液体的一抗没加甘油的话尽量不要放在负二十,因为用的时候反复冻融不好。粉末状的二抗负二十就行了sayaya(站内联系TA)液体的一抗直接放-80度贮藏,可保存5年以上;液体的一抗加50%甘
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问
WB显示培养基中的外分泌蛋白大于胞内的,这种结果正常吗,蛋白分泌到胞外大小会发生改变吗
bamboopiggy
蛋白分泌出胞外,一般会变小,因为要经过剪切。你是跑的native的胶还是denature的胶?会不会是你的分泌蛋白形成了高级结果?
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问
蛋白质和脂质互作都有什么实验可以验证?
dxywode
如果你搜“PIP Strips”,就会发现,它是脂质与蛋白质相互作用的研究神器。Echelon专攻各种抗体、分析检测试剂盒、抑制剂等科研领域,尤其擅长以细胞信号、脂类代谢和标记物研究为主。为研究治疗诸如癌症、糖尿病、炎症、感染和心脑血管疾病专家提供了有效的科研工具。PIP条带是2 x 6 cm的疏水膜,其上有100 pmol的八种磷脂酰肌醇和七种其他重要的生物脂质。它们用于在简单的蛋白质-脂质叠加
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问
蛋白经凝胶过滤层析后,杂蛋白(与目的蛋白相差30kDa )不能分离开,有改善办法吗?
天一湖医者
分不开一般可以选择其他的层析手段分离,比如离子交换或者疏水
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问
本人最近在做蛋白表达,蛋白表达在包涵体,用的是8M尿素进行溶解,但是溶解的总是不完全!这是为什么呢?
lyang556
可以尝一下以下方法:1. 提高pH值,比如pH10或以上;2. 添加高浓度还原剂如DTT等;3. 提高溶解的温度;4. 借助其他物理方法如超声波等。
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问
IHC-P,IHC-Fr和IHC-Fl切片固定条件(浓度,温度,时间等)和注意事项有哪些?
丁香粉猪猪
对组织浸蜡时,一般选用56℃~58℃熔点的石蜡,浸蜡温度最好不超过60℃,防止抗原的损失。
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问
在显色设备支持的情况下,荧光显色和化学发光显色,如何选择?
迟C迟
关注这么几点就好了,灵敏度要高,稳定性要好,背景要低,成本最好越低越好,几种方法各有优缺点。现在化学发光显色试剂盒ECL灵敏度最高的能够达到飞克级别了,不仅灵敏度要高,检测范围也要广,我们前段时间试了炎熙的极敏型试剂盒,灵敏度很高,也有其他灵敏度的可以选择,例如增强型,超敏型,稳定性都很好。
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问
提取动物蛋白时加入5倍裂解液时,需要根据每样组织重量进行计算,还是可以用统一的量加?
晴天飞扬秀
根据重量加,组织重量和裂解液有个比例
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问
酵母RNA提取实验的水解为什么用酸进行水解而不是用碱水解?
未来9
其实是碱水解,碱性水浴条件下RNA水解为寡聚核苷酸而DNA不水解,调pH为了沉淀DNA,调pH为酸性环境可以沉淀原有的和碱性条件下水解少量蛋白质产生的氨基酸
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问
Co-IP实验中如何去除重链、轻链的影响?
迟C迟
捕获抗体、检测抗体采用不同来源物种,使用针对检测抗体物种的特异性二抗;如果有可能,捕获抗体采用没有恒定区的纳米抗体。
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问
用Co-IP验证出两个蛋白互作,但是其他验证方式却不互作,是不是Co-IP不可靠?
迟C迟
COIP跟其他验证蛋白互作的实验比起来可信度还是很高的,投文章编辑也是认可度比较高的。如果实在对实验结果有所怀疑,建议重复。
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问
蛋白质提取纯化实验中,第一步在原材料中加缓冲盐溶液体积如何确定?提取环境温度设在多少合适?
万千490
稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,温度高利于溶解,缩短提取时间。但另一方面,温度升高会使蛋白质变性失活,因此,基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温(5度以下)操作。为了避免蛋白质提取过程中的降
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问
请问果汁有机酸含量测定这个实验怎么做?
迟C迟
请参考GB 5009.157-2016,食品中有机酸含量测定有详细步骤。
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问
请问离心柱型质粒小提试剂盒中的CP3吸附柱与离心柱型通用型DNA纯化回收试剂盒中的CB2吸附柱有什么不同吗
dxywode
离心柱型质粒小提试剂盒中的CP3吸附柱采用碱裂解法裂解细胞并提取质粒。其基于离心纯化柱能够在高盐状态下特异性地与溶液中的DNA 结合,而在低盐状态下进行DNA 洗脱的特性,实现质粒DNA 的快速纯化。使用本试剂盒提取的质粒DNA 可适用于各种后续试验操作,如:酶切,PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染部分细胞等。离心柱型通用型DNA纯化回收试剂盒中本试剂盒采用特殊的离心吸附材料,既能
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