• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购

        western blot实验条带颜色整体都很深,是什么原因造成的?做完了还能再改进么?

        相关实验:蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)

        user-title

        淡泊悠然

        wx-share
        分享

        7 个回答

        user-title

        xiaojie17

        有帮助

        做完了还想改进基本不会太好看,还是要控制背景值,洗脱干净。一般照相的软件可以调整一下曝光度,具体怎么调可以尝试一下。

        user-title

        毛桃子啊

        有帮助

        1.未进行非特异性封闭或封闭不充分

        延长封闭时间,考虑更换合适的封闭剂。 推荐 5% 脱脂奶粉、3% BSA 或血清封闭 30 分钟。

        2.一抗浓度过高

        稀释抗体至合适浓度,以更高稀释度抗体孵育更长时间(耗时长但特异性结合最好)。

        3.孵育温度过高

        4 ℃ 下孵育。

        4.二抗与封闭剂非特异性结合或反应

        设置二抗对照(不加一抗)。

        5.一抗或二抗与封闭剂有交叉反应

        在孵育和洗涤液中加入温和去污剂如吐温 -20。脱脂奶粉含有酪蛋白,该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白,会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。使用BSA代替奶粉作为封闭剂。

        6.未结合蛋白质洗涤不充分

        增加洗涤次数。

        7.膜的选择导致的高背景

        NC 膜比 PVDF 膜背景低。

        8.膜干燥

        在孵育过程中防止膜变干,在任何步骤都保证膜有充分的反应液,放入搅拌子不断搅动或轻轻振荡使膜浸在溶液中,避免出现干膜现象。

        user-title

        lyang556

        有帮助

        可能原因:

        1.一抗或/和二抗浓度太深,孵育时间过长。可以降低一二抗的浓度比例和孵育时间

        2.封闭时间短。可适当延长封闭时间。

        3.洗膜时间和次数不够。可适当增加,5miundefined5次或者10miundefined3次。

        user-title

        whilt-shirt

        有帮助

        可能是封闭不彻底,建议更换封闭液,用TBST多洗几次

        user-title

        邓豆豆逗

        有帮助

        可能原因有很多,你可以逐个排查:

        1.封闭时间不够或封闭液不行,建议用5%脱脂奶粉封闭,封闭时间至少1h;

        2.洗液被污染或一抗和二抗洗涤不充分,建议更换新鲜洗液,同时延长洗涤时间和次数,比如增加到5次,每次5mim;

        3.ecl发光液是超敏ecl,可以用tbst稀释一下或者用普通ecl曝光;

        4.pvdf膜被污染,操作过程中一定不能用手碰到膜,很容易粘上脏东西被污染;

        5.如果是组织提取蛋白做实验的话,可能存在杂蛋白干扰,建议上样前高速离心一下;或者是蛋白丰度太高,可以减少上样量再尝试;

        6.一抗有问题,可以带一个阳性对照一起实验,如果阳性对照也做不出来,那就说明是抗体问题了;

        user-title

        bamboopiggy

        有帮助

        可能二抗浓度太高了,将条带用洗膜液洗洗,然后重新加稀释的二抗,显影

        user-title

        dxywode

        有帮助
        背景深是在Western blot发光检测中最常见的问题,造成背景深的原因很多。第一,封闭的问题,封闭条件一般为5%牛奶或BAS室温封闭2-4h,但最好4度过夜;实际上牛奶对于多数抗体来说效果不错,但二抗与牛奶可能有交叉反应,因此洗涤很重要。另外BSA蛋白单一,可降低因牛奶其他成分引起的背景。第二,TBST洗脱不彻底也会导致背景深,适当增加洗脱时间、次数、用量可以减轻背景颜色,有时候膜没有完全均匀的浸润也是原因之一。第三,条带背景深也与曝光时间有关,曝光时间超过半小时出现背景是很正常的,所以可以的话建议曝光1-10min。第四,抗体浓度太高也会导致背景高,建议实验前进行检测。
        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序