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问
WB的泛抗体实验中,为什么总是出现只有一条带的情况?
bamboopiggy
你说是泛素化抗体么?如果是的话,可能因为你那个泛素化的蛋白,在出条带的大小表达的最多,所以曝光浅的时候,能看到一条带,而不是多条带
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问
300kd大小的蛋白分子转膜时间如何控制呢?
迟C迟
相对来说,大分子蛋白用湿转更好。如果想快一点就加大电压,正常两个小时差不多。
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问
做荧光定量PCR和半定量PCR有什么区别?半定量的PCR退火温度和荧光定量PCR是一样的吗?
迟C迟
荧光定量PCR和半定量RT-PCR都可以用来检测基因的表达量的,但二者检测的东西多少有些不同。荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入可以和双链DNA特异性结合的荧光染料(SYBR green)或者和目的DNA片段结合的荧光探针(taqman),通过监控PCR过程中的荧光的变化,并且和某些管家基因的荧光变化进行对比反应出目标基因的表达量。荧光定量PCR的主要有效数据是荧光信号增长到最大值的一半时的时
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问
请问做实时荧光定量PCR实验时,为什么做标准曲线?可以不做标曲吗?实验新手,求指导!
迟C迟
做标曲才可以算出这对引物的扩增效率(其斜率),方便用pfaffl方法来进行相对定量(得到的结果相对精确一点),否则只能默认扩增效率为2,用2^-ddCt(Livak)法来计算,做标曲才可以绝对定量。
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问
TaqMan荧光探针和SYBR Green荧光探针怎么选择?
迟C迟
TaqMan荧光探针和SYBR Green荧光探针更准确。SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下,SYBR Green I发出微弱的荧光,但一旦与双链DNA结合后,荧光大大增强。因此,SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关,可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I 的最大吸收
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问
荧光定量pcr TaqMan探针,标准曲线不好,ct值没有按等差数列增加,怎么办?
迟C迟
这个应该是你的模板没稀释准确,或者浓度不合适,如果是数据不成直线,全还是很平滑的曲线,可以勉强用曲线处理。如果不平滑,R方值很小,恐怕结果不太可靠了,只得重做,如果不能重做,只能舍弃不好的数据,用另几个数据得到方程,算出结果,但结果的可靠性就差了,只能对付一下。
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问
跑出来的胶,杂带太多,怎么回事儿?目的条带都看不清,被杂带覆盖了。
whilt-shirt
可能是抗体浓度过高导致的,建议稀释抗体试试
4 回答
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问
蛋白质样品可以反复冻融吗?
迟C迟
蛋白样品不建议久存,也不要反复冻融。 下游做WB实验,建议蛋白浓度测定后,加入loading buffer煮样,煮后根据实验需要分装成小管在-80℃,下次使用前拿出小管再次煮样即可。
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问
WB条带曝光的时候,有一大部分阴影覆盖在条带上,是什么原因
丁香粉猪猪
原因:蛋白量太大,一抗浓度和时间太长 解决办法:根据情况调整蛋白量,同时一抗浓度和时间也可以缩短。 经验:这种情况很容易出现,因为很多原因都可能导致这一个结果。一般来说,蛋白量都是我们经过很多次摸索得出的最适蛋白量,因此不太可能是蛋白量过多引起的。最有可能的是因为一抗浓度太高,作用时间太长引起的。另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减漏,建议5min*5次,不要但是洗这么多次就把抗体和蛋白洗掉了,你又不
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问
请问有做磷酸化的蛋白,造模时间不同,做出来结果完全相反的吗?
whilt-shirt
首先得确定造模是成功的,建议重复试试
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问
组织TNF-a表达用什么方法看
vae1476
可以用免疫组化,免疫荧光看,比较直观,也可以裂解成细胞,RTPCR或者WB来看
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问
如何确定WB结果中目的蛋白位置高于预测位置的原因
whilt-shirt
可以通过更换不同的marker来确定
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问
WB条带周围总是黑黑的一团,不知道怎么回事
未来9
可能的原因①膜封闭不够,建议延长封闭的时间;选择合适的封闭液。②一抗稀释度不适宜,太高,选择最适宜的抗体稀释度。③ 一抗孵育的温度偏高,建议4℃过夜孵育。④选择的膜容易产生高背景,一般NC膜的背景会比PVDF膜低,但是NC膜吸附力也就差了一点。⑤膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过,实验过程中要注意保持膜的湿润,使用镊子夹取膜。⑥检测时曝光时间过长,可减少曝光时间。
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问
为什么WB条带一个位置总是有两条,只敷了一种蛋白?
whilt-shirt
可能是抗体的特异性不好,也有可能是抗体浓度过高
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问
跑出来的带总是很弯曲是哪里出了问题?
whilt-shirt
配胶没混匀,或者电泳液有问题。
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问
请问,敷抗低温过夜和常温2h,效果差别大吗?
天一湖医者
差别很大的,建议低温过夜,常温2小时有有可能会不显!
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问
请问大分子目的蛋白,本底表达低,每次跑出来都只能看见maker,目的条带都很若,有什么解决的办法嘛?
迟C迟
推荐使用Tris-Acetate 凝胶跑大分子蛋白,会呈现更高的分辨率。凝胶浓度与孔径成反比,即凝胶浓度越小,孔越大,较大分子量的蛋白质更容易通过,所以建议使用6-8%浓度的分离胶,当然也可以使用梯度凝胶。
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问
WB条带白色背景黑色是什么原因?
dxy_yjs8h877
很多时候是因为封闭的不好,或者洗膜洗的不干净的原因导致的。
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问
跑蛋白胶的maker用多少合适呢?
dxy_yjs8h877
一般为了节省都用5ul左右就够了,怕不好点样的话可以适当稀释一下然后加大用量也可以。
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问
southern blot 的限制性内切酶怎么选呀,为什么我酶切跑胶,啥也没跑出来?
vae1476
在目的基因上选取一段作为探针。注意探针的特异性,选择一个探针序列内部没有的就可以作酶切位点
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