300kd大小的蛋白分子转膜时间如何控制呢？

相对来说，大分子蛋白用湿转更好。如果想快一点就加大电压，正常两个小时差不多。

大分子量WB主要难度在电泳上，孵抗体什么的和小分子量的没什么区别：1.将单叉和双叉的比例由1：29改为1：60，这将极大的增加胶联的孔径。2.分离胶用6%，浓缩胶4%，在剥胶的时候会发现胶非常的稀软，像鼻涕一样，但它毕竟是成型的，有一点耐心，小心的把它从板子上剥下来。3.电泳时间：选择分子量最大的预染MARKER，比如250kd，然后在电泳槽周围堆满冰，120ma使劲跑吧，跑两个小时换一次电泳液，一直跑到250kd的MARKER，离开胶释放到电泳液中，大概要用5个小时。这时候400kd的蛋白在离开浓缩胶边界0.5~1cm的地方。4.转膜：虽然湿转更好，但当时实验室只有半干转膜仪，于是加大电压1h，就OK了，时间再长就太热了。5.孵育抗体什么的都是一样的，但是建议蛋白上样量大一点，毕竟转膜不会转的很干净，会有损失的，而且大分子量的带一般不会很平齐，因为分子量大很多是由于糖基化修饰的缘故，每个蛋白不能保证都修饰的一模一样。

300mA转3h,就可以，但是要用低浓度的胶。转膜后。看下类似大小的marker过去没有。

湿转：0.2PVDF膜 甲醇浸润5s ，转膜液：10%甲醇 + 0.1%SDS ， 转膜条件：30v 4° 过夜转20h 左右

虽然湿转更好，可以半干转膜仪加大电压1h，就好了，时间再长就太热了

时间尽量不要超过2小时，注意控制温度，及时持续降温

转移时间需要相应延长(至少300mA，3h或以上)；