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问
怎么构建一种能在细胞中产生环状RNA的质粒?有什么参考资料?
汤姆卜丽波
参考一下这个文章https://wap.cnki.net/touch/web/Conference/Article/ZGXJ201711001258.html
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问
mRNA疫苗,质粒加A尾,怎么构建质粒?
汤姆卜丽波
就是基因工程的一部分,获取目的基因,载体。酶切,连接,转化,挑单克隆,验证。
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问
单酶切之后用T4连接酶构载,菌长了满板,pcr验证全是空载。
灵枢天问
这个体系是按摩尔比来的么,你测目的基因和载体浓度了么
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问
质粒构建中,pcDNA3.1(+)上,插入两个蛋白,选用什么启动子?各启动子会有干扰吗?
灵枢天问
CMV吧,如果是两个启动子合负责一个片段,那只要插入位点合适,没有其他干扰
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问
构建点突变基因载体,突变效率低,有没有好用的酶。
bamboopiggy
好像有个专门做点突变的kit,你可以找找看,如果不行,建议做长引物pcr来做突变点。
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问
膜蛋白的提取效率低,而且检测到大多数为阶段后的蛋白
汤姆卜丽波
以下是提膜蛋白的protocol, 有些注意要点,是不是没有注意到, 1.将离心管柱及接收管套管放置冰上预冷。 2.细胞样品,贴壁细胞样品建议使用细胞刮刀收集,尽量不使用胰酶消化,细胞量为 20-50 X 106 个细胞。 3a.用预冷的 PBS 清洗一次细胞。Buffer A 中重悬细胞(起始细胞数小于 5X 106 加入 200ul Buffer A,起始细胞数大于 5X 106 加入
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问
求助大佬们,酵母单杂的点板结果不明显,空载和目的基因启动子共转在不同浓度抑制剂的缺陷板上都能长,是表示没有互作吗?谢谢!
汤姆卜丽波
首先确定你的培养基各个组分没有受到蛋白胨,酵母粉等的污染,重新按照上述配方配制MD。然后需要确定你的感受态是不是有问题:分别划板MD,YPD(倒平板时加点氨苄和卡那,防止E.coli的污染。)
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问
PCR产物跑完核酸胶以后泳道里有拖尾
汤姆卜丽波
有蛋白污染的可能吗?或者PCR的退火温度适当可以提高一些以减少引物和模板的非特异结合。适当减少PCR体系的模板量。
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问
请问提取植物DNA时如何有效的去除酚类和多糖物质
bamboopiggy
取植物材料研磨后加入核酸分离缓冲液和2-巯基乙醇,混匀后置水浴中;离心机中离心后弃上清;加入1×PBS溶液,研磨仪上震荡混匀,离心后弃上清;向沉淀中加入预热的3×CTAB裂解液并混匀,水浴裂解;加等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀,离心;取上清,加入等体积氯仿/异戊醇混合液,混匀,离心;取上清,加入NaCl和冰异丙醇,混匀,沉淀1~3小时;取出离心后,将沉淀用乙醇洗涤,风干后加TE溶解,即完成提取
4 回答
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问
CRISPR/CAS9质粒转染试剂以及靶位点DNA引物设计?
bamboopiggy
如果你习惯用PEI25K也是可以的,按照你平时做质转的配比做就可以。也可以直接转染你的肿瘤细胞收样做pcr,然后T7E1酶切。至于靶位点的引物,只要在靶位点上下游大概能产生700-900bp的pcr产物就可以。
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问
琼脂糖凝胶电泳拖尾的原因,用的是KOD酶预混mix做PCR,以前能跑出清晰条带,现将试剂都尝试换了遍,都没改善
dxy_oeu11rar
不知道marker是不是也有拖尾现象,如果marker正常,有可能是你的模板浓度太高。如果marker不正常,排查一下琼脂糖凝胶和缓冲液的问题,buffer不正确也可能产生拖尾
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问
Tag1酶酶切后失败的原因?
mxy5120
限制性内切酶的量不够。酶切的时间不充足
7 回答
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问
DNA重组相关问题?
急诊科ys
用高效连接酶连,400U或2000U,还可延长反应时间
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问
测序结果为什么看不到我克隆的酶切位点?
Junego
测序引物距离你的酶切位点有多长?如果引物到酶切位点过近或太远都测不到的。一条引物测序结果可信长度就700-800bp,要不换条引物试试。
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问
PCR结果怎么看?如何区分真假阳?
dxy_oeu11rar
通过琼脂糖凝胶电泳可以看到pcr结果,设置阴阳对照可以区分真假阳性,通常情况下阴性对照设置成水对照,即体系中不加入DNA模板,如果阴性对照无条带,结果更加可信
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问
已经测序正确的菌液,再提质粒时发现酶切验证切不开,酶活性没问题。酶切位点之前也是切过得。是什么原因呢
dxy_l3h8h19
是不是操作有误啊?还有,已经测序正确了为什么还要酶切验证?如果是单酶切的话切没切开可能差距不大,看不出来有没有切开。
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问
用自配试剂提质粒时,p1溶液应该加多少RNA酶?P3和P2ph必须要达到规定值么?酚氯仿可以合并么?
dxy_oeu11rar
p1 RNAase的量我用的100ug/ml酚氯仿我用的是酚:氯仿:异戊醇=25:24:1p2没调过ph,p3的ph=4.8
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问
10倍溶液稀释到1倍溶液是用水还是生理盐水配啊
whilt-shirt
看你做的实验,如果最终的稀释溶液作用于细胞或者动物或者组织,那就需要用PBS或者生理盐水稀释,如果是用于非生物样本,那一般是用水
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问
如何用购买的阳性质粒制作转基因含量0.01%的阳性样品?例如:已知一个35s质粒,86bp,5微克,干粉。
bamboopiggy
可以参考一下这个专利:https://patents.google.com/patent/CN1718743A/zh本发明公开了一种转基因烟草检测方法,包括(一)巢式PCR定性检测:获得可用于PCR反应的样本DNA,同时检测样本的花椰菜花叶病毒启动子调控序列CaMV 35s、根癌农杆菌终止子调控序列nos和抗卡那霉素选择标记基因序列NPT II,引物的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1至SE
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问
无缝克隆如何设计引物?引物一般设计多长?很长的引物需要找公司定制吗?
此用户已注销
根据同源臂设计引物,一般15-20bp。很长的引物需要找公司定制。
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