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        DNA重组相关问题?

        相关实验:DNA 体外重组

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        浪子在天涯

        载体和目的基因片段都用NotI单酶切,并对载体进行去磷酸化,但是载体和片段连接不上,是什么原因?

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        8 个回答

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        急诊科ys

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        用高效连接酶连,400U或2000U,还可延长反应时间

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        灵枢天问

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        还是要先确保酶切是成功的,然后回收回来的片段浓度够,连接时载体与目的基因的比例,连接酶都要保证

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        汤姆卜丽波

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        先保证连接酶的活性。然后连接时间,普通连接要过夜,可以试试用快连

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        天一湖医者

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        去磷酸化后因自身5'端无磷酸基团,因而不可以和自身3'端连接。但是,载体去磷酸化后3’还是有羟基的,可以与目的片段的5'端磷酸基团连接。载体的5'端和目的片断的3’-OH不能成键,因而形成一个双链各有一个切口的双链环状DNA,双链的切口会在转化入大肠杆菌后,在复制的过程中被修复。

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        迟C迟

        有帮助

        检查连接步骤,如果实在连不上,可以尝试其他连接方法,比如无缝克隆之类的。

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        bamboopiggy

        有帮助

        你插入片段加磷酸了吗?把你插入片段进行加ATP处理可能会好一些

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        lyang556

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        用NEB的高效连接酶连看看,用400U或2000U的试试,另外可以延长反应时间,16℃过夜连接或者用很长时间试试!

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        未来9

        有帮助

        1、用NEB的高效连接酶连看看,用400U或2000U的试试。

        2、16度过夜连接;

        3、失活的方法很多了,可以加热(有的热敏感酶可以),可以直接过胶回收柱子,但比较放心的方法就是跑胶回收。

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