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问
PCR跑胶条带还可以,切胶回收浓度是负的.
balalaLy
回收试剂盒试剂有没有弄混,溶胶的过程胶有没有完全溶解,回收最后一步建议用50度左右的buffer溶解产物,可以加大产物得率
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问
如何判断pcr样本是否污染,怎么避免?
dxy_g9y5gije
pcr样本污染是指模板污染还是整个体系污染呢如果是体系,那么做好阴性克隆和阳性克隆就可以判断如果是模板的话,考虑重新获取模板比对
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问
做了三次qpcr独立重复,前两次都有相同趋势,第三次出现了严重反差,实验过程是没问题的操作也很严谨,这种情况要怎么办呢
dxy_g9y5gije
遇到这种情况建议详细记录实验过程再次尝试,因为导致这种结果出现的情况太多了,需要逐一排除
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问
当PCR产物有两条带的时候,怎么才能快速提高特异性?
Miracle星
出现多条条带表示PCR反应的特异性不高,可以进行如下优化尝试:1.适当提高PCR的退火温度。退火温度越高,DNA分子之间的配对越困难。这样可以减少引物与模板之间非特异性的结合。2.检查一下引物的Tm值和序列结构,如果引物Tm值过高,上下游引物Tm值相差太大,或者引物单链易形成高级结构,都不利于PCR反应。必要时重新设计引物。3.检查一下模板纯否。模板越纯,条带越特异。反之模板杂乱(例如cDNA文库
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问
我是要扩增一个片段,加上双酶切位点,片段就那么大,我就需要那么大加酶切位点?这引物怎么设计?是不是只要5‘端序列,以及3’端的反
dxy_j7jezao0
5'端加上酶切位点不影响你扩增目的片段,网上用软件设计可以直观作出对引物的评价。你也可以自己设计,符合一些引物设计原则就好
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问
我设计的引物为:上游引物:TCC CCCGGG ATGGCTCCACTTCACGAATC下游引物:ATAAGAAT GCGGCC
bamboopiggy
你能不能换个酶?你选的这两个酶,全是GC的,本身就会导致TM值升高,再加上上游起始序列中GC含量也比较高,所以你换个酶比较合适。
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问
普通pcr引物设计和荧光定量pcr引物设计的区别
dxy_j7jezao0
qPCR为保证扩增效率,产物片段较小,70-250bp,TM值一般60左右其他差别较小
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问
实时荧光定量PCR 的引物能不能用来做RT
dxy_j7jezao0
下游引物可以,这就是RT中所说的特异引物
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问
荧光定量PCR熔解曲线出现多峰是什么原因?怎么解决?
bamboopiggy
一般情况是引物不特异,可能有多个产物。不能用,换个引物。
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问
请问 PCR引物长度24点情况下,错配几个碱基仍能P出来、基本不影响效率?
dxy_j7jezao0
不确定,引物特异性主要受3'端序列影响,错配在5'端,影响较小。
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问
如何针对致泻性大肠ETEC的stp和sth基因设计特异性强且有效的引物和Taqman探针?能够使Ct值小一点,荧光强度值大一点
Miracle星
1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。2、引物GC含量一般为40%-60%, 45-55%为宜,GC含量过高或过低都不利于引发反应,上下游引物GC含量和Tm值要保持接近,一般Tm值不超过5℃。3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间,最好为72℃左右。4、引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修
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问
qRT-PCR模板稀释比例一般为多少啊?
cq2019
我都是按照1:5的比例来稀释,跑出来的结果非常好
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问
定量Pcr时候怎么减少加样导致的误差
cq2019
为了尽量减少由于加样导致的误差,可以把混合液加完后,最后再加cDNA,加的时候枪头不要深入液体面,同时每加一个孔都要换枪头,最后2000r/min离心
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问
求Bacmid BMON14272 图谱或序列
bamboopiggy
你可以参考一下这个公司给的说明书,他们不让我贴连接,我把pdf的头给你贴上。你自己找来看看吧
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问
已经逆转录之后的cdna,化冻以后上样扩增之前可以涡旋吗?
cq2019
cDNA还是比较稳定,可以瞬时涡旋震荡的
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问
免疫共沉淀实验,总是假阳性,该如何避免
天一湖医者
免疫沉淀的假阳性一般來自洗过的免疫沉淀物中存在的某些蛋白质,这些污染物在完整细胞内不与目的蛋白相互结合,但在细胞裂解后可形成非生理条件的蛋白质与蛋白质的相互作用,也可能来自抗体与其他非目的蛋白的交叉反应,(这在做western很常见),或者非特异性反应.为了排除这种假阳性可采用几种方法:一是采用几种不同抗体.如用几种不同的cmyc抗体去IP,可增加结果的可信度,另外也可以采用对照抗体,如与你的抗体
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问
sw620形态正常吗
天一湖医者
从图片上看,这个sw620形态还是正常的。
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问
CFW荧光染色染尖孢镰刀菌菌丝染不上怎么办?
bamboopiggy
是不是你的溶液A失效了?你试试延长一下溶液A染色的时间?增加到2min试试
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问
用0.3%戊巴比妥钠麻醉小鼠,给药体积0.1-0.2ml/10g,剂量为多少mg/kg?
天一湖医者
用0.3%戊巴比妥钠麻醉小鼠,给药体积0.1-0.2ml/10g,剂量一般是40mg/kg左右.
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问
基因敲除后验证问题。
天一湖医者
首先你要考虑,你所加的抗性浓度是否足够,在你要做的细菌中的抗性浓度与所使用的浓度不是一致的。其次,你的自杀载体真的进去了吗,电转真的转化进去了。再者你要双交换或者单交换的同源区有多大呢,不同菌对同源区要求很不一样;
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