实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问菌落PCR胶孔堵塞没有条带

汤姆卜丽波

不是的，那种情况是pcr产物里有蛋白质污染才会那样，在胶孔里，跑不下来

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问PCR 封板膜有好多种类型，哪种实验效果更好呢？

bamboopiggy

其实都可以，只要你每次实验用的都是同一个牌子的就没有问题，还有就是你自己封，要封紧。虽然这么说，我还是推荐用国外大品牌的，透光度和密闭性都好一些

3 回答333 围观

问qPCR的内参应该怎么选

汤姆卜丽波

内参主要的作用就是校正和标准化，

4 回答1298 围观

问real time RT-PCR如何保证重复性

bamboopiggy

这个不是污染不污染的，只要你加样准，一般问题就不大，加样准，前提是枪和枪尖要match，保证每次加进去的样本量是一致的

4 回答437 围观

问在菌落PCR时能够获得条带但是测序并没有该序列是什么原因？

bamboopiggy

可能是你的seqA有复杂结构，测不过去，你试试从你的insert seq中设计测序引物，分别往两端p，能不能把两个seq给p出来

3 回答2669 围观

问overlap PCR时有一段序列怎么都连接不成功都有可能是什么原因？

bamboopiggy

实在不行的话，把另外两段构建好的情况下，用酶切的方法，插入第三段。

3 回答584 围观

问如何通过qpcr.测定基因敲除鼠基因的表达情况(主要是样品浓度不太一致)

bamboopiggy

收样品，然后提RNA，调整浓度，做逆转，然后跑qpcr，与内参值进行比较。其实你是基因敲除，做wb可能更能说明问题。

3 回答200 围观

问【扩增启动子】有时候同样的条件，第一次能扩增出来有单一明亮的条带，第二次就没有条带，这是什么原因呢？对于启动子扩增有什么建议吗？

汤姆卜丽波

没有条带的话，是不是操作过程中导致样本降解了

4 回答159 围观

问易错pcr 可以用普通的pcr mix 做吗？

汤姆卜丽波

不可以的。易错pcr体系中用到的镁离子浓度和普通的不一样，还要加锰离子提高突变率

4 回答587 围观

问定量PCR和半定量一般对象检验的周期在多久

汤姆卜丽波

定量pcr一般两小时，大约40个循环。半定量的话就看你的实验目的，最多不超过35个循环。

4 回答397 围观

问overlap pcr 如何设计引物？有何注意事项？

汤姆卜丽波

重叠延伸pcr的引物设计:引物F及R为基因两端特异引物，其中Fm及Rm为中间引物。其中引物Fm及Rm中间共享一段序列（至少10bp完全匹配），为突变点，突变点最好是位于引物的5’端，尽量避免出现在3’端。然后分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对进行PCR。该步一定要用pfu酶，不能用Taq酶，因为Taq酶容易在PCR 产物末端加A，会造成产物移码突变。其余标准和普通pcr一致的

4 回答13948 围观

问转座子反向PCR 的问题

天一湖医者

查一下LM-PCR，按照步骤做就好，也有可能是你引物设计的不对，要仔细分析序列。

3 回答418 围观

问反转录pcr试剂盒中随机引物合成片段的原理是什么，大小会不会不一样

bamboopiggy

随机引物：某些特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列，比较难以转录成全长序列时，可采用非特异的随机引物来转录全长mRNA。选择这种引物，体系中所有RNA分子会全部充当DNA第一链模板，然后PCR引物在下游扩增过程中再扩增特异的目的基因。通常，用此引物合成的cDNA中，96%来源于rRNA。Oligo(dT)：绝大多数真核细胞的mRNA具有3’端Poly(A+)尾，所以使用Oligo(dT)仅mR

3 回答926 围观

问巢式PCR是利用PCR的产物又进行了一次PCR吗？巢式PCR的产物在跑胶时样品不进胶是怎么回事，试过调Ph值，但是不管用

汤姆卜丽波

可能不是ph的问题，有可能是pcr产物蛋白污染了，所以在孔洞里不进胶

3 回答530 围观

问关于探针特异性的问题

bamboopiggy

优先考虑探针位置 • 探针的5'端第一个碱基不能是G • 基因表达探针Tm值：68-70C；基因分型探针Tm值：65-67C • TaqMan探针长度13-30bp，TaqMan-MGB探针长度在13-25bp • 避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G • C比G多的探针效果更好，如果C少于G，选择其互补链 • 多态位点应尽量位于探针中央，可以±3个碱基

3 回答762 围观

问PCR的适用范围和主要针对对象是毒性实验吗

天一湖医者

不是的，PCR的适用范围和主要针对对象不仅是毒性实验，还有其他很多方向。

3 回答400 围观

问PCR产物量过少的原因是什么

whilt-shirt

有可能是引物特异性不强或者试剂有问题

5 回答2141 围观

问有关PCR的问题，大神求助呀：

Miracle星

七条带，只跑出一条带原因可能：a DNA marker 上样量不够按照说明书加样，或者根据自己的实验样品调整加样。b DNA电泳跑出凝胶电泳时，将溴酚蓝跑到胶长的2/3处即可停止电泳。更小的DNA片段可能需要电泳的时间更短。比如1/2c DNA条带被示踪染料所遮盖选用不同的电泳loading dye，使待检测的DNA样品避开示踪染料的干扰，或者适当降低loading dye用量。d 凝胶中未加核酸

3 回答559 围观

问请问有没有能够快速评价引物的质量以及评价一对引物是否匹配的软件或者在线网址？

balalaLy

primer/oligo/dnaman

4 回答366 围观

问请教：细菌病毒的核酸怎么不能用A260鉴定提取好坏？

汤姆卜丽波

核酸提取好坏的鉴定是根据260/280以及260/230的，不单单是 260

2 回答369 围观

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