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        求救!大肠杆菌原生质体制备方法

        相关实验:利用 PCR 分析酵母菌落

        user-title

        实验小助理静静

        请问大家,有没有人成功制备过大肠杆菌原生质体,我买了碧云天的溶菌酶,用有胞内荧光的菌看,要不然就是没变化还是杆,要不然就是破了,没有原生质体形成,而且反应后的液体离心后也黏黏的,是buffer有问题吗,求成功的大佬分享方法

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        3 个回答

        user-title

        迟C迟

        有帮助

        1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C下过夜培养

        2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用

        3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升),保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用

        4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板摇瓶中

        5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时

        6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次)

        7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时)

        8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天)

        9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升),然后加水稀释至离心管的2/3体积。

        10. 照上面步骤重复离心,小心弃去上清液

        11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞

        12. 离心,弃上清液

        13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)

        15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml

        16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存

        user-title

        天一湖医者

        有帮助

        可以看下大肠杆菌原生质体制备的方法。图片描述图片描述图片描述

        user-title

        秋秋欣欣

        有帮助

        以0.3%浓度的溶菌酶,37度作用45min

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