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科研学霸天团，48小时有问必答

问到底用石蜡切片还是冰冻切片做免疫荧光效果更好？为什么？怎么选择？

莹啊免疫啊

石蜡切片免疫组化，冰冻切片免疫荧光，冰冻快，新鲜，石蜡好保存，麻烦，有些一抗不能用于石蜡切片

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问请教ELISPOT斑点模糊问题

西柚味的芋圆

我的推测是包被的抗体的问题。你这个我自己包被的时候遇到过，但是已经包被好的板子这样的话，不知道原因，是不是没洗干净呢，洗板液要用PBS不能用PBST

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问染色后发现 FITC 荧光全部在胞浆内是什么原因？如何进行实验步骤？

西柚味的芋圆

有的抗原收是膜抗原，比如说某些CD分子，但是，实验中发现，胞浆中也有，是不是因为该蛋白表达过程中，需要中胞浆转运到胞膜，所以，实验中发现胞浆中也有荧光

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问用冰冻切片做免疫荧光的抗体选择问题

颜渊溪桥

能做细胞免疫荧光的一般都可以，抗体上会写IF,但有时候抗体上不写也可以试试，但特异性很重要，要做好isotype对照

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问为什么做了两次免疫组化鉴定细胞都呈现的是黑色的？

dxy_zutyknhe

可能是没有进行固定和破膜，也要注意是不是贴片反了

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问用免疫荧光的方法检测 LC3 可以么？怎么计算？

西柚味的芋圆

免疫荧光染的是会同时染LC3I 和II 的，这种方法也没问题，在正常细胞和受刺激的细胞中都会有LC3的光点，二者的区别是受刺激的成团块状，正常的呈散点状。。。在一些可能会影响LC3的翻译的条件下，可能受刺激的细胞表现为光点也会变多，这个好理解。。。而在自噬基础水平比较低的状态，给了刺激可能也看不出太大区别时可以考虑转染，相当于给个放大镜，放大这一过程。

7 回答5386 围观

问过程中发现有的小鼠炸毛有的没有炸毛，不知道这是什么原因？

dxy_zutyknhe

可能是抗原毒性引起的，一般跟免疫效果是没有直接关系的，炸毛可能是小鼠身体不太好吧

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问在ELISPOT结果中出现不规则的大块斑点，有的区域没有斑点是什么原因？

西柚味的芋圆

培养期间不要移动 plate，并且采取措施防止蒸发，可以使用铝箔纸包裹 plate。细胞去除不完全会破坏 spot 的形成。HRP 结合物（HRP-conjugates）不能在含有叠氮化钠的 buffer 中使用，因为叠氮化钠会抑制酶的活性。残留的底物会引起孔中的色斑。

7 回答381 围观

问关于小鼠肾脏冰冻切片直接免疫荧光问题2

莹啊免疫啊

冷丙酮固定10min.染色后-20保存，能放一个月，特别长时间的话，不然用石蜡？

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问石蜡切片免疫荧光背景很脏什么原因？怎么办？

颜渊溪桥

建议先看下抗体是否适合做免疫荧光，另外可以染个DAPI聚下焦，操作过程除了洗和封闭外，抗原修复步骤需要改善，可以试下不用 H2O2阻断。

16 回答1880 围观

问关于小鼠肾脏冰冻切片直接免疫荧光问题1

西柚味的芋圆

当然需要罐洗，我一般用4百分之四的多聚甲醛进行罐柱

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问抗体非还原胶显示多种状态，怎么判断活性占比，如何更好分离？

peaceful13

不同条带的区别主要是分子量大小的不同～想要的组分需要了解你的目标抗体的分子量大小通过marker的条带去确定该分子量位置，如果纯化效果不佳～可以考虑一下protein G

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问组织免疫荧光失败问题

西柚味的芋圆

可能是二抗保存不放。这种散在的光点就要看你的洗液了，最后一步封片之前要用去离子水而不是pbs洗，这些非特异性的光点可能是离子染色导致的

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问消化的染色质浓度过低怎么处理？

丁香实验

如果染色质制备物的 DNA 浓度接近于 50 μg/ml，则向每次 IP 中添加额外的染色质以确保每次 IP 至少产生 5 μg，然后继续实验。②在交联之前计算备用平板上细胞的数量，以确定准确的细胞数量，在声波处理前后在显微镜下观察胞核，以证实胞核完全裂解。

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问为什么我的ChIP实验做出来，结果就是不理想呢？为得到理想的ChIP结果，怎么优化实验条件？

丁香实验

1、染色质的制备：为了获得足量的染色质，我们的样品准备一定要充足。（IP实验的损耗较大，为保证实验用量，一次准备5×10E7个以上细胞较好）2、优化交联固定条件：ChIP实验成功与否，直接取决于染色质完整性、抗原表位质量和抗体特异性（抗体一定买好的）。因此优化交联固定条件，富集丰度更高。3、优化染色质片段化条件：要得到理想的ChIP结果，合适长度和浓度的染色质样品至关重要。（推荐的片段化程度

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问免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？尤其是微波修复。

丁香实验

关于抗原修复，我个人的观点和panther75有点不同。我试过的修复条件有EDTA热修复，柠檬酸钠为缓冲液的微波修复以及高压锅修复。从我的实验结果来看，微波修复其实很不容易掉片子的，而EDTA热修复和高压锅修复是很容易掉片子的。因为掉片子主要是因为加热过程中产生的气泡所引起，而微波修复水加热到沸腾，沾在片子上的气泡就会少，不会因为小气泡上串引起脱片。做EDTA修复时，你可以将片子靠的尽量近些，或是

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问DNA、mRNA和蛋白质–这是一个悲伤的故事

7月未央

哭着哭着，蛋白就水解了。（= =|||||||||||||||||）DNA终于又转录了一个mRNA。DNA说：“你好，我是你的模板。”mRNA说：“你好，我是mRNA。”DNA仔细地看着mRNA：“你和他，真是一模一样。”mRNA：“谁？”DNA：“我上一次转录的mRNA。”停了停，又说：“你们明明是一样的，为什么我还在想念他呢？”说完，DNA慢慢合上了眼睛（…）。如果相遇的尽头注定是错过，是不是

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问DNA的分子量估算

ajun333333

核酸、核苷酸的基本换算1．核酸的换算：(1)摩尔数与质量：1 μg 1,000bp DNA = 1.52 pmol1 μg pUC18/19 DNA (2,688bp) = 0.57 pmol1 μg pBR322 DNA (4,361bp) = 0.35 pmol1 μg SV40 DNA (5,243bp) = 0.29 pmol1 μg FX174 DNA (5,386bp) = 0.28

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问冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么？

丁香实验

1、从一抗的选择方面来看。有的一抗既能做石蜡切片又能做冰冻切片，而有的一抗只能做冰冻切片，关键取决于所要检测的抗原稳定性，有的抗原不稳定，经过组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等一系列的做石蜡切片的步骤，所检测的抗原易被破坏，这时只能用冰冻切片来做，检测这类抗原的一抗只能做冰冻切片，而那些稳定的抗原，能经受住石蜡切片的的考验，一般来讲也可以用冰冻切片来做，总得来讲，对于既可以用冰冻切片也可以用

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问一抗孵育的条件和浓度如何摸索？

丁香实验

1、孵育条件选择：根据大量外文文献参考，4度过夜的最多，37度或直接室温的较少。故可以按照4度过夜+室温或37度复温（增进抗体抗原结合和防止脱片）。2、组织切片的选择：仅选择某一组同一只动物标本，这样才有可比性，且最好是预想肯定阳性的组别中的动物切片。3、一抗浓度摸索：主要参照说明书推荐的浓度，并结合文献中对于某种组织的大概浓度范围，同时也要考虑不同公司之间同一抗体的浓度和效价的不同。从最高浓度向

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