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        原核表达IPTG诱导问题求助

        相关实验:IPTG 诱导蛋白表达实验

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        2332

        1、表达菌:BL21(DE3)pLysS;载体质粒pET-3c;培养条件37℃,220rpm

        2、最近表达一段小肽3kD左右,诱导表达的时候发现加入诱导剂IPTG后菌体明显减少,含空载质粒和重组质粒的表达菌都有很明显的减少,且进行诱导的实验组没发现明显的目的条带

        3、换过其他来源的pET-3c和表达菌,重新制备感受肽和转化、诱导,但是制备感受态的Cacl2没有换,结果还是会明显减少;用过其他课题组的IPTG,同样会明显减少,但是不如自己组的减少得多

        4、使用不同时期同组师兄用同一个载体构建的其他目的蛋白重组载体,进行同时诱导的时候,师兄的表达菌诱导后没有明显减少

        4、看到有帖子说转数和温度会影响,但是具体针对本实验的影响情况还没做验证

        想问一下大家有遇到过类似的问题吗,求建议

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        4 个回答

        user-title

        sswei

        有帮助

        反应条件较复杂,特别是对自己设计的引物来说,选择合适的退火温度,是需要慢慢摸索的,一般根据计算的退火温度降低5~10℃来进行首次扩增,如果出现了目的条带,且有杂带时,在逐步提高退火温度,以提高反应的特异性。此外,还有反应体系,电泳条件,时间等等因素。

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        你师兄的表达菌诱导后没有明显减少,你的减少了,首先应检查你们两个的实验条件是否相同,这个实验条件对诱导结果影响很大,建议先统一诱导条件

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        以下是可能的原因和解决方案:

        感染性噬菌体的污染:BL21(DE3)pLysS菌株会表达T7裂解蛋白(T7 lysozyme),抑制感染性噬菌体(例如lambda噬菌体)的复制,保证载体在细胞中稳定存在。如果存在感染性噬菌体的污染,会导致载体丢失、细胞死亡等问题。建议进行细菌溶液的滴度扩增实验(例如使用TA法),排除感染性噬菌体的污染。

        转化效率不稳定:不同的菌株、不同的质粒、不同的DNA片段都会影响转化效率。建议进行转化效率的测定,确认转化效率是否稳定,如果不稳定,可以优化化学电转化条件或电转化条件。

        IPTG浓度和诱导时间的选择:IPTG的浓度和诱导时间会直接影响目的蛋白的表达量和菌体的生长状态。建议优化IPTG浓度和诱导时间,找到最佳条件进行表达。另外,如果发现诱导后细菌的生长速度很慢,可以考虑添加一些辅助生长因子,如氨基酸等。

        质粒构建和目的蛋白的选择:质粒的大小、复杂度、目的蛋白的大小、复杂度都会影响表达效果。建议优化质粒构建和目的蛋白的选择,选用适合的载体和宿主菌株,或者进行分段表达或蛋白工程优化。

        菌株处理和培养条件的优化:菌株的处理和培养条件也会影响表达效果。建议优化菌株的处理和培养条件,包括菌株的处理方式、菌液的密度、培养时间、培养温度、培养介质等。

        总之,原核表达是一个复杂的过程,可能存在多种因素影响表达效果。建议系统地排查以上可能的原因,并进行逐步的优化和改进。

        user-title

        huarenqiang5

        有帮助

        考虑可能是IPTG的浓度过高,形成了包涵体。

        建议降低IPTG浓度和诱导温度,掌握好诱导时间试试。

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