材料与仪器
【试剂】
BSA、蛋白标准液、PBS、试剂 A（1％ BCA，二钠盐，2％ 无水碳酸钠，0.16% 酒石酸钠，0.4％ 氢氧化钠，0.95％ 碳酸氢钠，混合调 PH 值至 11.25）、试剂 B（4％ 硫酸铜）；
【器材】
分光光度计
步骤
- 蛋白标准品的准备
配制 25mg/ml 的蛋白标准溶液：30mg BSA 于 1.2ml 蛋白标准配制液，-20℃ 保存。配制 1ml 0.5mg/ml 蛋白标准溶液，-20℃ 保存。
|
25mg/ml 蛋白标准溶液 |
PBS |
|
20ul |
980ul |
- BCA工作液的配制
BCA试剂（A:B）=50:1，混匀，室温 24h 稳定。
- 标准曲线绘制（20ul 体系）
|
0.5mg/ml BCA(ul) |
0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
|
PBS |
20 | 19 | 18 | 16 | 12 | 8 | 4 | 0 |
| 蛋白质（ug） | 0 | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
- 各孔加入 200ul BCA 工作液，混均匀，37℃ 放置 20-30min
(注: 也可以室温放置 2 小时，或 60ºC 放置 30 分钟。BCA 法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。)
- 562nm 下比色测定
- 以吸光值为横坐标，蛋白含量（ug）为纵坐标，绘出标准曲线
- 蛋白浓度检测
- 各孔加入 200ul BCA 工作液，每孔加入 20ul 稀释液（1ul 待测样品+19ul PBS）
- 混均匀，37℃ 放置 20-30min
- 562nm 下比色测定
- 在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（ug）
注意事项
如果接种同样密度的细胞，类似处理条件，目测细胞数量基本一致，那么可以直接用 SDS loading buffer 裂解 30min，不定量直接上样跑 WB。建议丽春红染色拍照作为记录。
来源：丁香实验
