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        【资源】原核表达-IPTG诱导原理 及 一些疑问

        丁香园论坛

        8123

        最近在做原核的诱导表达,现对原核表达IPTG诱导原理进行总结,同时在一楼也有一些问题,欢迎大家拍砖!!!

        乳糖(Lac)操纵子(operator)学说:当葡萄糖和乳糖同时存在时,细菌优先利用葡糖糖,当葡萄糖利用完以后,细菌经历一个生长停滞期,开始利用乳糖,细菌会出现“二次生产曲线”。

        乳糖操纵子的基因表达受 阻碍蛋白 和 CAP(分解代谢产物的

        激活蛋白,又称CRP,cAMP receptor protein)的双重调控。

        乳糖操纵子的结构:

        其中Plac I 和 Tlac I分别为编码乳糖抑制物蛋白的启动子和终止子,“i”代表inhibitor其结构也可简化为:

        首先讲下阻碍蛋白的调控原理:当培养基中无乳糖时,阻碍蛋白与操纵子O结合,阻断了RNA聚合酶与启动子P的进一步反应。

        而IPTG能与阻碍蛋白结合,使转录反应进一步发生

        CAP的调控原理:可加强转录活性,细菌才能合成足够的酶来利用乳糖

        葡萄糖→ →降解产物(能抑制腺苷酸环化酶活性)

        ATP → →cAMP(需腺苷酸环化酶)

        上述两个反应导致:葡萄糖存在时,cAMP浓度低;仅在葡萄糖消耗完毕时, cAMP浓度增高,CAP-cAMP 复合物形成(结合于lac operon CAP结合位点),才会促进转录;

        同时附上其具体的诱导原理:

        1. E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节 基因I。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。

        在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激 活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表 达 。

        2.在没有乳糖存在时,lac
        操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结 合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导。

        在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经β-半乳糖苷酶催化,转变为异乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。

        异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的作用与异乳糖相同,是一 种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。

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