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科研学霸天团,48小时有问必答
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ELISA抗原包被问题
西柚味的芋圆
4度过夜(指12h)包被效果不太好. 包被抗原浓度不确定,没定量,可能你的蛋白量太少(最有可能) 没有封闭的步骤 一抗稀释倍数不清 你的洗涤影响不会很大,一般没问题.
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问
将酶免疫技术中的间接法改为一步法合理么?
peaceful13
可以的~主要是一步法的检测灵敏度会比较低,
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问
实验OD值偏差问题,想知道哪里出错误了
颜渊溪桥
首先前提是标准曲线做的没有问题,那么第二次的样品需要稀释后检测呢,是否样品中的本来前胶原含量就比较多。
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Elisa标曲问题
西柚味的芋圆
你看一下试剂盒推荐用哪个拟合方式,不同的试剂盒会不同。可以直线,可以曲线的
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问
多组实验下想根据OD值计算样本浓度,应该如何计算?
莹啊免疫啊
按每组的算,每组都可能会有不同阴阳对照的值,不能完全统一
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问
请问elisa实验中,空白、阳性对照、阴性对照均显色,可能是什么原因?
西柚味的芋圆
那肯定是你洗板子没有洗干净。或者你在加样的过程中导致标准品漏了
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问
Elisa数据负值怎么才能做出正的来?
西柚味的芋圆
blank孔是否污染了吧 样本是否浓度是否在曲线范围之内3 、板子是否脏?导致孔与孔之间不一致
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问
如何检测两个蛋白质相互作用的强弱?
丁香实验
免疫共沉淀Co-IP。1. 转染,A与WT/MUT分别共转细胞;2. 裂解后,用anti-A抗体与lysates孵;加入结合抗体的proteinA/G beads结合;3. 洗beads。4. 洗脱。5. WB, 观看结合在beads上的A,B多少。A做内参control。看结合的B的差别。
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问
染色质消化不足且片段过大(大于 900 bp)怎么处理?
丁香实验
①确定甲醛浓度,将交联时间缩短至 10 分钟或更短。②在交联之前计算平板上细胞的数量,以确定准确的细胞数量;③适当延长染色质消化时间。
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问
MS到底能不能实现ip后pg级别的蛋白组学分析?
丁香实验
pg级别鉴定是问题不大。问题有几点。主要判定依据是你ip下来的内源性蛋白在整个样品中有没有可能超过鉴定的下限。理论上10万细胞不算少,实际也是对应蛋白质组学而言。但是考虑到你ip的条件,目标蛋白的内源性丰度,非特异结合的蛋白的情况,不能下定论能不能鉴定到。建议尝试。
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问
诱导表达不出蛋白
ZhangDss
后来实验室的老师建议我用BL21(DE3)plys表达,现在还在试,不知道是不是菌种的原因。
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问
蛋白表达自动诱导系统以及大幅度提高产量
lithlin00
包含体的形成与否与普通IPTG诱导的结果相当,我经验看来,可溶性的效果上可能还好些,因为乳糖的诱导不同于IPTG,它要经过好几个过程,同时它又是碳源之一,所以它的诱导是很温和的一个过程,而IPTG是很剧烈的一个过程,浓度高的时候,蛋白的折叠速度就会跟不上表达速度,导致包含体的形成。我在IPTG诱导时的两个可溶性蛋白,在5052系统中也是完全可溶的。我一直用的Rosetta(DE3)plys,你应该
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问
能否在一个表达载体里插入两个蛋白实现同时表达
dupli
完全可以,楼主所说共表达不是融合表达,是共同表达。如果是真核表达,把两个表达框构建到一个载体上进行转化或转染就可以实现共表达了,有一些现成的用于共表达的载体。动物细胞中还有IRES载体可用于共表达。如果是大肠杆菌或其他原核生物共表达,可以构建两个顺反子到一个载体上,但是步骤可能会比较多,载体比较大,可能会影响质粒复制而影响表达效果。而如果两个顺反子有较大同源部分,则还需要考虑因重组导致的不稳定。N
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问
请问elisa实验中,空白、阳性对照、阴性对照均显色,可能是什么原因?
sfnana
您好,楼主,请问你的问题解决了吗?我现在也是出现了跟你一样的问题,阴性,空白值都很高。(我做的是双抗体夹心,biotin标记的抗体 1:1000 100uL/孔,亲和素1:5000) 样本 (O.D.450 nm) 阴性 (O.D.450 nm) 空白(O.D.450 nm) 2.5310
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问
培养液分泌蛋白质谱前处理
青木书生
非标,具体原理你可以去看看我之前的帖子。你这个实验,前期定量在这个实验里面非常重要,毕竟全蛋白如果TIC差距过大,normalization还有个内参蛋白参考。建议送样前跑胶定量。DTT,IAA的母液可以使用10mM-50mM的NH4HCO3溶液,也可以用水配母液。具体工作浓度varies a lot by studios,自查JPR或者MCP文章。IAA注意避光配置,避光孵育,不宜反应时间过长。
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【求助】泛素化出不来!
卡戎3521
反过来拉,用ha抗体做诱饵蛋白,fkag显色。。我开始就是转myc/his-Ub质粒跟Flag-A蛋白的质粒,使用Flag做诱饵蛋白,但是每次都搞不出来。。后来看了很多文献,有的就是用Ni直接拉His这种方法,我用类似的His抗体做,成功率就还可以,目的蛋白的上方有多个条带,对照里面就没有~~
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一个质谱结果想请教大家如何分析
黑糊糊2000
这结果应该是PD sequest search result。我们从来不用score。都是PSM vaule. 你的结果是IP 那应该和negative control 比。但是你要注意low psm 不代表这个就是 false positive. 因为这个PSM 和蛋白长度也相关所以低PSM 不见的就不好。IP 的结果一般你的bait 会有最高的PSM 有时候也会是heatshock 或者 ri
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问
做Akt的Western blot为什么要做P-Akt和总Akt?
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低丰度表达的蛋白做WB有什么好方法吗?
丁香实验
低丰度蛋白用WB检测的确会有些困难,但第二张我看到目的条带了,既然丰度低就意味着非特异性结合会提高,我建议你有两点:1,二抗浓度的把握要精准,在能呈现目的条带时降低二抗非特异性结合的概率2增加Tween-20的工作浓度,用更改过的工作浓度去配置TBST清洗,背景的效果可能会改善不少,自然而然目的条带也会展现出来了。
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CHIP超声后DNA浓度上不去,求助大神
xue454962321
按照CST9005试剂盒描述是抽提了细胞核,之后Micrococcal Nuclease酶切是在保证细胞核完整的状态下做的,离心之后需要的是沉淀(细胞核),这个时候上清里面是没有东西的,因为细胞核还没有被破膜;之后再把细胞核沉淀裂解,用超声的方法帮助破核膜,在离心取上清。此时,蛋白和核酸都应该在上清里面。如果你提取的是Micrococcal Nuclease酶切之后的上清,那应该就是没有DNA的;
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