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问
琼脂糖凝胶电泳冰上进行是不是可以防止电泳缓冲液过热导致的条带拖尾?
迟C迟
琼脂糖凝胶电泳没必要在冰上进行,只要样品没问题,没降解没污染,一般条带也不会拖尾。
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问
请问超声随机切断DNA为什么被淘汰了?有什么弊端吗?现在这个微球菌核酸酶又有什么优点呢?
Eason老歌迷
你都说了,超声是随机切断,那肯定,没有酶切法好。它一个随机切断,没有确定性,一个是酶切,有固定位点。
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问
分子克隆实验中出现很少或者没有转化子的原因是什么?
迟C迟
考虑以下几个原因:1、抗生素有没有用错,检查载体抗性。2、转化过程是否成功,电激转化还是化学转化,转化条件是否正确。3、感受态细胞是否可用,有没有低温保存,是否在操作过程中失活,实在不行建议买商业化感受态细胞。
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问
磁珠法核酸DNA提取里常用的磁珠有羧基和羟基磁珠,两个有什么区别吗?
bamboopiggy
多亏你问这个问题,我才能学到:常用核酸提取结合液,PuriMag Si-OH磁珠和PuriMag Si-COOH均能对核酸有效吸附。一般来说,在离液盐体系,PuriMag Si-OH磁珠对核酸吸附效果相对较优;在PEG体系,PuriMag Si-COOH对DNA和RNA吸附效果相对较好。不同尺寸磁珠,悬浮差异明显,尺寸越小悬浮性越好,但磁响应会减弱。一般用于核酸含量较低的小样本,选用悬浮性好的磁珠
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问
核酸电泳出现这种弥散条带是什么原因
未来9
PCR条带弥散原因 1、 PCR 体系中存在污染 2、电泳槽中电泳缓冲液不净 3、电压不稳定 4、如果 PCR 的模板是经过酒精提取的质粒等相关 DNA,则酒精没有除净 5、退火时间过长或过短
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问
pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳后可以不在凝胶成像仪紫外灯下切胶吗?
bamboopiggy
可以,你可以放个尺子,标记好位置,关了紫外切。
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问
扩增得到的DNA条带弥散,是引物问题吗
Wuwuy
扩增得到的DNA条带弥散,是引物问题吗?考虑是不是跑完的胶在室温放了很久,或者4度过夜再拍的,一般这种情况拍下来是会弥散的。
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问
设计引物的小技巧除了从TM值,GC含量,专一性(基因特定区域)考虑,还有别的吗
bamboopiggy
看你的目的了,如果是realimte的引物,还需要跨内含子。普通pcr的话,还要看酶切位点。
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问
用DH5a转化的时候除了42度热激1分钟,再一小时复苏是不是还有别的方法?
lzy必有我师
热激时间的确定与装感受态所用的离心管厚度有关系,所以你会看到不同的说明书上介绍的热激时间不一样,你可以自己做个梯度试一下,一般来讲30-90s之间都是可以的,当然转化率有些许的差异
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问
用cDNA扩增一个5000+bp的基因扩增不出来,实验室已有的各种酶都试了,另一个同时扩增的2000bp基因扩增出来了
Wuwuy
用cDNA扩增一个5000+bp的基因扩增不出来,实验室已有的各种酶都试了,另一个同时扩增的2000bp基因扩增出来了。5000直接扩太长了,也很容易出错,一般师兄师姐的做法是分成几段扩,并且测序检测是否有错
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问
加入竞争探针后,游离探针条带变弱,请问这是什么原因呢?
Eason老歌迷
加完竞争的探针,应该都是阳性带变潜或者不出现的,你那种状况可能是:1. 加竞争探针时候加错了又把标记的探针加了一边2.如果没有,你在重复一下实验,有时候在封闭和洗涤的时候整个膜不是很均匀,就会出现在某个部位出现比较深的背景, 有可能刚好是在竞争的地方出现的,我以前做过不少EMSA实验,不均匀经常发生,试着重复一下看看结果!
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问
怎么设计构建能产生出circRNA的质粒?
bamboopiggy
因其独特的首位相连结构,可以让其更不容易被核酸酶降解,有着比线性RNA分子更长的半衰期。现在主流认为circRNA形成主要有以下三种方式:A:侧翼内含子自身互补配对; B:RNA 结合蛋白驱动; C:mRNA 前体剪接时外显子跳读形成套索。第五代circRNA过表达载体有pCD5-ciR、pCD25-ciR、pLO5-ciR、pLC5-ciR、pK5ssAAV-ciR和pK25ssAAV-ciR,
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问
扩增长片段DNA, 使用高保真酶和普通的普通Taq酶,哪种更容易扩增呢?
bamboopiggy
两种酶都容易扩增,但是看你的实验目的,如果要做克隆,则需要用高保真酶,防止突变,如果只是做鉴定,可以用普通Taq 酶
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问
将载体和目的片段(PCR扩增产物,约500bp,两端设有酶切位点)分别用EcoR1和BamH1双酶切后,定向连接。但载体上该双酶
未来9
可以选择那个和设计不相同的那一端的酶切位点先做连接,之后再进行平化连接, 这样就可以避免所设计中的有重复酶切位点的问题了。部分酶切关键是酶切时间,可以先摸索一下酶切的时间。在一个大一点的体系中(比如150微升体系),37度酶切,然后每隔一段时间取出一部分(比如5微升或10微升),然后一起进行核酸电泳,摸索一下合适的酶切时间,部分前切的话,时间应该不能太长,可以每间隔5分钟或10分钟左右就取一次。
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问
一个质粒的双酶切,两种酶buffer一样,同时切胶。跑胶时,一个小片段看不到,大概600bp,怎么办?根据Marker把需要的4
bamboopiggy
第一步先确定你的酶切的酶没有所问题,所以要做两个单酶切的对照,然后看单酶切和双酶的长切片段的大小,如果有差异,说明酶没有问题。否则重新买酶。第二步,一定要胶回收,需要去除乙醇沉淀带进去的杂质,否则会影响下一步的连接
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问
试剂盒提取质粒后电泳一片弥散,无目的条带,这是哪个步骤出问题了?
bamboopiggy
感觉是你没有连接成功,平板上长的都是杂菌。你下次做个不加连接产物的阴性对照看看,如果和阴性对照长的差不多,那就是连接产物要么没有连接成功,要么没有转到大肠杆菌里去。
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问
各种基因的模板质粒应该到哪里买,怎么买?有些实在是没办法用cDNA再pcr扩增出来出来,但是用模板扩增的就很好,这是怎么一回事?
bamboopiggy
一般网上有公司可以买,你也可以去addgene上看看,那个比较全。 cDNA是rna反转录得到得,并不是DNA得全长,而是长度不同的cDNA的一个mix,所以做RT pcr的时候,两个引物之间的距离一般是50-200bo
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问
为什么产生了非特异性条带?
天一湖医者
1.抗体浓度过高;降低一抗、二抗的浓度,可以分梯度进行。2.一抗的特异性不足;使用单克隆抗体,单克隆位点的抗原表位是唯一的,多克隆位点的表位不唯一。3.二抗的非特异性结合,不加一抗,其他操作不变,即可检测出二抗的非特异性的条带是否来自二抗的非特异性结合;此时需要重新选择二抗。4.样品蛋白质上样量过大;降低上样量,可以分梯度进行。
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问
为什么我的扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅?
bamboopiggy
是所有的都这样么?会不会是1.你胶漏了,2,你的引物不特意,没有得到特异性的pcr产物。
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问
为什么我的扩增产物滞留在加样孔中!
dxy_ck6nxntw
在加样孔没有跑,电泳的电压不够也是原因,或者胶的浓度和电泳液浓度不一样,或者你的胶正负极放反了。
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