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科研学霸天团，48小时有问必答

问扩增得到的DNA条带弥散，是引物问题吗

Wuwuy

扩增得到的DNA条带弥散，是引物问题吗？考虑是不是跑完的胶在室温放了很久，或者4度过夜再拍的，一般这种情况拍下来是会弥散的。

6 回答477 围观

问设计引物的小技巧除了从TM值，GC含量，专一性（基因特定区域）考虑，还有别的吗

bamboopiggy

看你的目的了，如果是realimte的引物，还需要跨内含子。普通pcr的话，还要看酶切位点。

3 回答385 围观

问用DH5a转化的时候除了42度热激1分钟，再一小时复苏是不是还有别的方法？

lzy必有我师

热激时间的确定与装感受态所用的离心管厚度有关系，所以你会看到不同的说明书上介绍的热激时间不一样，你可以自己做个梯度试一下，一般来讲30-90s之间都是可以的，当然转化率有些许的差异

7 回答3927 围观

问用cDNA扩增一个5000+bp的基因扩增不出来，实验室已有的各种酶都试了，另一个同时扩增的2000bp基因扩增出来了

Wuwuy

用cDNA扩增一个5000+bp的基因扩增不出来，实验室已有的各种酶都试了，另一个同时扩增的2000bp基因扩增出来了。5000直接扩太长了，也很容易出错，一般师兄师姐的做法是分成几段扩，并且测序检测是否有错

8 回答627 围观

问加入竞争探针后，游离探针条带变弱，请问这是什么原因呢？

Eason老歌迷

加完竞争的探针,应该都是阳性带变潜或者不出现的,你那种状况可能是:1. 加竞争探针时候加错了又把标记的探针加了一边2.如果没有,你在重复一下实验,有时候在封闭和洗涤的时候整个膜不是很均匀,就会出现在某个部位出现比较深的背景, 有可能刚好是在竞争的地方出现的,我以前做过不少EMSA实验,不均匀经常发生,试着重复一下看看结果!

3 回答499 围观

问怎么设计构建能产生出circRNA的质粒？

bamboopiggy

因其独特的首位相连结构，可以让其更不容易被核酸酶降解，有着比线性RNA分子更长的半衰期。现在主流认为circRNA形成主要有以下三种方式：A：侧翼内含子自身互补配对; B：RNA 结合蛋白驱动; C：mRNA 前体剪接时外显子跳读形成套索。第五代circRNA过表达载体有pCD5-ciR、pCD25-ciR、pLO5-ciR、pLC5-ciR、pK5ssAAV-ciR和pK25ssAAV-ciR，

4 回答1619 围观

问扩增长片段DNA, 使用高保真酶和普通的普通Taq酶，哪种更容易扩增呢？

bamboopiggy

两种酶都容易扩增，但是看你的实验目的，如果要做克隆，则需要用高保真酶，防止突变，如果只是做鉴定，可以用普通Taq 酶

5 回答687 围观

问将载体和目的片段（PCR扩增产物，约500bp,两端设有酶切位点）分别用EcoR1和BamH1双酶切后，定向连接。但载体上该双酶

未来9

可以选择那个和设计不相同的那一端的酶切位点先做连接，之后再进行平化连接，这样就可以避免所设计中的有重复酶切位点的问题了。部分酶切关键是酶切时间，可以先摸索一下酶切的时间。在一个大一点的体系中(比如150微升体系)，37度酶切，然后每隔一段时间取出一部分(比如5微升或10微升)，然后一起进行核酸电泳，摸索一下合适的酶切时间，部分前切的话，时间应该不能太长，可以每间隔5分钟或10分钟左右就取一次。

4 回答1366 围观

问一个质粒的双酶切，两种酶buffer一样，同时切胶。跑胶时，一个小片段看不到，大概600bp，怎么办？根据Marker把需要的4

bamboopiggy

第一步先确定你的酶切的酶没有所问题，所以要做两个单酶切的对照，然后看单酶切和双酶的长切片段的大小，如果有差异，说明酶没有问题。否则重新买酶。第二步，一定要胶回收，需要去除乙醇沉淀带进去的杂质，否则会影响下一步的连接

4 回答951 围观

问试剂盒提取质粒后电泳一片弥散，无目的条带，这是哪个步骤出问题了？

bamboopiggy

感觉是你没有连接成功，平板上长的都是杂菌。你下次做个不加连接产物的阴性对照看看，如果和阴性对照长的差不多，那就是连接产物要么没有连接成功，要么没有转到大肠杆菌里去。

3 回答1338 围观

问各种基因的模板质粒应该到哪里买，怎么买？有些实在是没办法用cDNA再pcr扩增出来出来，但是用模板扩增的就很好，这是怎么一回事？

bamboopiggy

一般网上有公司可以买，你也可以去addgene上看看，那个比较全。 cDNA是rna反转录得到得，并不是DNA得全长，而是长度不同的cDNA的一个mix，所以做RT pcr的时候，两个引物之间的距离一般是50-200bo

3 回答366 围观

问为什么产生了非特异性条带?

天一湖医者

1.抗体浓度过高；降低一抗、二抗的浓度，可以分梯度进行。2.一抗的特异性不足；使用单克隆抗体，单克隆位点的抗原表位是唯一的，多克隆位点的表位不唯一。3.二抗的非特异性结合，不加一抗，其他操作不变，即可检测出二抗的非特异性的条带是否来自二抗的非特异性结合；此时需要重新选择二抗。4.样品蛋白质上样量过大；降低上样量，可以分梯度进行。

3 回答3566 围观

问为什么我的扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅?

bamboopiggy

是所有的都这样么？会不会是1.你胶漏了，2，你的引物不特意，没有得到特异性的pcr产物。

3 回答391 围观

问为什么我的扩增产物滞留在加样孔中!

dxy_ck6nxntw

在加样孔没有跑，电泳的电压不够也是原因，或者胶的浓度和电泳液浓度不一样，或者你的胶正负极放反了。

5 回答1980 围观

问PCR实验什么情况下需要使用RNase H？

丁香清香

RNase H可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。当PCR实验RNA/DNA杂合体不能正常水解时，需要考虑使用

4 回答538 围观

问用cDNA扩增一个基因,总是扩增出带有内含子的片段，怎么办

丁香清香

1. 任何一个时刻，提取的RNA里有尚未完全加工成熟的mRNA.2. 不管是否去除gDNA污染，都无法改变事实。只有靠marker去寻找正确长度的片段克隆，才能有可能得到不含内含子的基因片段。3. 注意灯下黑，如果测序引物位点离正向引物太短，正向引物可能不完整或有模糊碱基。

3 回答3428 围观

问克隆较长片段的基因组DNA的时候，怎么检测模板DNA是否合格？提DNA的时候有什么需要注意的地方？用什么方法提？

Eason老歌迷

提dna需要注意的点，比如说，你在操作时一定要轻柔，动作要缓和，避免剧烈运动

4 回答595 围观

问提取RNA前，发现Buffer GTC有沉淀物，怎么办？

天一湖医者

如果在加入异丙醇之后就有沉淀，这肯定是蛋白质。也可能是无机盐沉淀，什么碳酸钙之类的因为，不溶于水，又不溶于75%的乙醇。

3 回答417 围观

问测序结果中有时候为什么找不到引物序列? 

Eason老歌迷

用PCR引物作为测序引物进行测序时，所测序列是从引物3'末端后第一个碱基开始的，所以自然就找不到您的引物序列了。有两种方法可以得到您的引物序列。对于较短的PCR产物（<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互补序列。对于较长的序列，一个测序反应测不到头，因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中，用载体上的通用

3 回答2887 围观

问为什么需要使用无水乙醇来沉淀DNA?用95%乙醇可以吗？

bamboopiggy

原因：1.DNA不溶于乙醇2.乙醇可以吸附水分子（极性相同）,使得溶液中相对的水分子减少,增大了DNA在水中的相对浓度.3.附：乙醇沉淀DNA需要盐离子,用金属离子屏蔽DNA上磷酸的负电荷,降低DNA分子间的斥力,才能沉淀完全.可以用95%的，就是会增大液体的体积

5 回答6322 围观

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