用cDNA扩增一个5000+bp的基因扩增不出来，实验室已有的各种酶都试了，另一个同时扩增的2000bp基因扩增出来了

用cDNA扩增一个5000+bp的基因扩增不出来，实验室已有的各种酶都试了，另一个同时扩增的2000bp基因扩增出来了。5000直接扩太长了，也很容易出错，一般师兄师姐的做法是分成几段扩，并且测序检测是否有错

五千bp的基因太长了，比较难扩增。两千的比较容易。

一个是考虑更换模板，提高模板质量，可能会比较容易P出来，降低退火温度，多尝试各种酶。

另一个就是分段扩增，再用无缝克隆的方式连接起来。

用重叠延伸PCR吧，5kb太大了，就算P出来也不保真

我也遇见过类似的情况，但我的目的条带没有那么长，最后发现是引物设计的问题。我觉得你可以再换个引物试一下。

可能这个基因在你提取RNA所用的组织中不表达，查一下这个基因表达最高的那个组织（或者多尝试几个组织），然后提取这个组织中的RNA进行，反转录，作为模板，进行扩增。

再就是buffer建议用GC-rich buffer，

如果这个还不行的话，可以尝试嵌套式PCR。

5000bp太长了，不好扩增，你要不分段扩出来，再和起来？或者直接买一个得了。

以先扩增一下管家基因，若能扩初来，证明你的CDNA没有问题。

可能是因为逆转录不完全，有一部分的链没有打开，你可以换个好一点的逆转录试剂盒，或者你可以试试用分段克隆的方法分别设计引物，克隆出几段，然后连接起来。

可以试试用重叠延伸pcr方法连接几个片段的，就是在你的目的序列里找到几个酶切位点，在酶切位点处设计引物，分别扩增出几个片段，酶切并胶回收后进行粘性末端连接，连完再以这个为模板，用全序列的引物进行pcr。