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科研学霸天团，48小时有问必答

问无缝克隆如何设计引物？引物一般设计多长？很长的引物需要找公司定制吗？

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根据同源臂设计引物，一般15-20bp。很长的引物需要找公司定制。

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问酶切后DNA连接效率太低是什么原因？

灵枢天问

一、目的片段和载体片段的摩尔比很重要，但你的载体片段有多少pmol,应该有一定的pmol数，一般要0.03-0.1pmol，不能太低，不知道你的量有多少。换一下连接buffer，时间长加上反复冻融会很快失效，建议用新的。二、载体片段和目的片段的质量也很重要，想一下是否你的回收的质量怎样，是用什么方法得到的，如果质量不好，也是很难得到重组子的。还有就是确定一下T4连接酶没问题吧

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问酶切实验过程中遇到的问题？

汤姆卜丽波

从下面几个因素去考虑：1)　酶是否有活性：酶的活性单位通常是在60分钟酶切1ug λDNA或特定线状DNA所需要的酶量。鉴定酶的活性高低不是用待切的DNA模板，也不是别的公司的酶来判定。因为不同公司酶可能是从不同系统中纯化的，虽然识别位点相同，但是酶的特性可能是有差异的。鉴定酶必须使用使用说明书上认定的酶活确定的方式，通常需要用1λ DAN做模板来判定。同时如果酶对甲基化敏感，还需要用Dcm-,

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问QRTPCR结果如何分析

未来9

Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 (cycle)。所以不难推断出 ct 值越小，反应扩增到达平台期所需循环数越少，目的基因起始含量越高。下面我们用一个公式进行推导过程：（敲黑板，重点！）PCR 产物量 = 2∧ct * 起始模板量起始模板量 = PCR 产物量／2∧ct = 起始模板量 _2∧ - ct待检基因起始模板量 = PCR 产物量 _2∧ - c

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问提基因组跑电泳，亮度不够高是浓度问题吗？

bamboopiggy

看看跟marker的对比，一般亮度不够是浓度问题，但是你上样前，没有测浓度么？

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问为什么我在做DNA重组试验的时候，跑出来的条带总是弥散呢

dxy_gwrp7ndq

如果你的marker也有问题,极大可能是你制作凝胶或电泳的缓冲液有问题.请仔细检查是否为1X TE buffer.再次,请使用新鲜的agarose gel进行电泳,如果保存时间过长（即使是在4摄氏度下）,胶体也会出现问题.

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问我用高保真酶扩三个基因，用55度退火只有第一个有条带，然后用62度退火有两个扩出来了，但是出现了特异条带，最后一个一直P不来。

Eason老歌迷

GC含量较高，可以尝试使用GC buffer,或者加入DMSO。另外你的正反向引物Tm 值差的有点大的话可以尝试touchdown PCR ，或者尝试做一下梯度，摸索一下最适Tm。

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问在做体外哺乳动物染色体畸变的制片过程中，为什么染色效果会很差，基本很浅。而且细胞很难破裂。目前实验室

汤姆卜丽波

注意事项:1.秋水仙素的注射剂量与时间对观察中期染色体的形态影响很大。通常情况下,小鼠按4 P g/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素, 3一4h后处死小鼠,此时观察中期染色体特征明显。注射时间过短或过长,在镜下可见间期细胞多,而中期染色体形态少。如果在显微镜下能观察到50%一80%中期染色体,说明试验操作相当成功。2.制样时用装有2%柠檬酸钠溶液的注射器针反复吹洗。此外要防止注射针头阻塞。3.低渗处

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问为什么在做qpcr时会出现bar值过大？所有孔同样方法加入，会有一两个孔无数值出来？

急诊科ys

1.加样不准确。2.试剂室温存放时间过长或加样过程误差！3，系统错误

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问纯化质粒降解的相关问题？

dxy_n4jex0k8

会不会是溶化质粒的时候没有放冰上？溶得太快且高浓度质粒互相撞击影响质量？如果长时间，比如几年，可以把质粒转进去菌里面，然后-80保存，后期复苏也更方便。

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问细菌发酵液短链脂肪酸的测定

迟C迟

1用气相色谱法进行检测短链脂肪酸中含有羧基，其极性较大，可与气相色谱柱产生吸附作用，从而可影响色谱柱的重现性。因此，在用气相色谱法对短链脂肪酸进行检测前，需先对其进行衍生化。气相色谱中常见的衍生化试剂有 BF3- 甲醇、五氟苄基、苄基溴、N-（叔丁基二甲基硅烷基）-N- 甲基三氟乙酰胺及 1-（叔丁基二甲基硅烷基）咪唑等。进行气相色谱检测常用的检测器为氢离子火焰检测器，但由于待检的生物样品中短链脂

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问质粒构建技术过程中遇到的问题？

Junego

质粒提取的试剂盒已经很普遍了，主要是碱裂法+吸附柱，按照试剂盒说明书就可以。抓住一下关键的点：1.菌液新鲜制备：最好挑单菌落培养，4h左右活化后，再接种到试管中过夜培养。2.裂解要充分：菌液和裂解液有一定比例的，不要加太多菌，5mL菌获得的质粒足够克隆用很久（一般可以获得5-10μg）。3.质量控制：看产量和纯度，用Nanodrop定量。纯度的话，OD260/280为1.8-2.0，OD260/2

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问质粒提取过程中去蛋白液可以不加么？

汤姆卜丽波

去蛋白液PD可以有效去除残留的蛋白杂质，当宿主菌为endA+（TG1、BL21、HB101、 ET1256、JM101等）核酸酶含量较高的菌株时，强烈推荐使用去蛋白液PD。

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问菌液pcr条带弥散，是什么原因？

Junego

建议加一个阳性对照：可以确定引物、体系、程序是否有问题

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问质粒构建中，怎么在质粒上给基因加A尾？

迟C迟

平末端DNA加A的步骤一般是先纯化PCR产物，加入dATP Buffer，利用Taq 酶在平末端片段后加上A尾后才能与T载体的T头互补连接TA克隆。

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问挑取单克隆时重组单克隆有没有一定的特点，和空质粒不一样的那种

Eason老歌迷

单克隆筛选是根据细胞所具有的特性将单个细胞从混合的细胞样品中分离出来的⼀种技术，是抗体制备细胞株优化、稳转细胞株构建、药物靶点筛选等应⽤中重要的⼀环。具有以下特点:通用性筛选：适用于多种细胞，无需携带抗性荧光标签。单列线性模式：适用于高价值细胞。提供克隆性证据：可为每个克隆提供克隆形成图像。温和的微流控技术：更高存活率，更低损失率。

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问怎么对snp位点引入酶切位点，该点所在序列没有对应的酶切位点怎么办

Eason老歌迷

重组时选择你的目的基因上没有，而质粒的多克隆位点上有的酶切位点，一般重组质粒需要两个酶，所以你要选择两个酶切位点，注意尽量避免使用切出平末端的酶。重组引物设计时首先你要确定你选择的两个酶在的酶切位点在质粒的多克隆位点上的排列顺序，这个不能错，不然序列就会接反。一般设计重组引物的时候，在上游引物5’端前面加上载体多克隆位点排列在前面的酶切位点序列，在下游引物5‘端前面则加上后面的一个酶切位点，酶切位

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问质粒构建过程中DNA扩增的问题？

汤姆卜丽波

退火温度可以做个梯度，找到最合适的

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问严格厌氧菌的生长曲线测定

Eason老歌迷

三个标样平行试验的相对偏差应小于0.25%如果平行样相差大，那么你就得重新再做平行实验。是不是你没有摇匀呢?或者就是你吸样的时候没有操作好。

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问DNA的检测结果可以通过外界（如药物）进行人为干预吗？

dxywode

可以的，通过研究人类的DNA，对可能发生的疾病进行提前预知，研发出个性化的DNA药物，可以让人类延长生命。

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