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科研学霸天团，48小时有问必答

问为什么紫外分光光度法透光率会上升？

sswei

可能存在环境温度异常，强的照明或不稳定环境下工作等情况。

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问想问一下懂行的大佬，最近在用crisper cas9做基因的片段敲除，敲的是一株产油酵母里的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因。

huarenqiang5

敲除效率受多方面因素影响，建议从以下几点考虑： 1.基因敲除靶点应设计在起始密码子附近（包括起始密码子）或者起始密码子下游的外显子范围内。 2.不同靶点在基因敲除效率上有较大差异，因此同时设计构建 2～3 个靶点的基因敲除载体再从中选出敲减效果较佳的靶点。 3.N1-N20NGG 靠近 PAM 的碱基对靶点的特异性很重要，前 7～12 个碱基的错配对 Cas

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问为什么质粒转化涂平板前要离心

土井挞克树

涂板前要离心进行纯化，把杂质去除。

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问质粒DNA电泳条带异常是什么原因？

loveliufudan

可能有以下原因：DNA质量不佳：DNA质量不佳是导致电泳条带异常的常见原因。DNA质量不佳可能是由于DNA提取不完整、受到污染或降解等问题导致的。模板DNA浓度过高或过低：如果模板DNA浓度过高或过低，也可能导致电泳条带异常。如果浓度过高，可能会出现过度剪切的现象，导致出现长的拖带；如果浓度过低，则可能出现条带弱或消失的现象。酶切不完全或反应时间不足：如果质粒DNA未完全被酶切，或者酶切反应时间不

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问连接转化菌落验证时，挑单菌落➕10ul水，然后以此为模板跑PCR的话，会不会没挑到跑出来是空的呀，尤其是还想跑温度梯度的

申东熙老伯

挑大一点的单菌落，挑了之后放在培养基里，摇床摇几个小时再做PCR鉴定。跑温度梯度一般是跑的出来的。

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问大分子片段构建载体总是不成功

huarenqiang5

考虑以下问题：（1）buffer和酶切效率。同样受到内切酶的活力及buffer影响，值得注意的是不同厂家的内切酶一般匹配不同的buffer，所以在设计酶切引物时就应该优先核对buffer问题，同一厂家使用同一种buffer的两种酶酶切时可以同时加入两种酶进行酶切，节省实验时间，同时酶切效率会有所提高。（2）内切酶受到甲基化等因素影响一些限制性内切酶的酶切效率受到甲基化的影响，如MluI受GC甲基化

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问热蛋白组学实验，在用液氮冻融裂解hepG2细胞后，BCA定量细胞蛋白浓度过低是什么原因呢？

huarenqiang5

主要考虑：1.可能细胞状态不好；2.蛋白与蛋白间性质差异大；3.BCA反应非线性，测定时可能出现偏差，要精度准确，做标准曲线时的点设置多些；4.试剂BCA，一般最低检测限5ug/ml，灵敏度要达到1ug/ml，必须采取加强法测定，比如样品多加几倍。

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问pet28a质粒dna提取浓度低

土井挞克树

必须增加菌液量，目前来看就是上样量太少了，增加样本量

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问乳腺癌细胞相关问题提问

huarenqiang5

MDA-MB-468细胞表达EPCAM。

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问只有merge后黄色的荧光才能表示共定位吗？

huarenqiang5

这个不一定了，共定位受多种因素影响，共定位从物理角度来看，表示两种或多种颜色荧光分子发出的颜色占据图像中的相同像素。在生物学上，共定位是指两个或多个不同分子位于细胞中的同一结构。在数字成像的背景下，它可以被描述为多通道图像中的两种或更多荧光染料在空间重叠。共定位对于确定感兴趣结构的位置必不可少，当我们发现某一蛋白在细胞中其重要作用时进一步研究其在何处与何分子结

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问关于质粒在细胞中的表达问题

汤姆卜丽波

一般穿梭质粒都是入核的，要不然在细胞质没办法表达，入核之后就是正常的转录翻译了，会有剪接过程

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问southern blot转膜的速度和时间怎么把握

龙大人驾到

Southern blot转膜的速度和时间需要根据具体实验情况和转膜装置进行调整。以下是常见的建议和注意事项：转膜速度：转膜速度应该适中，不要过快也不要过慢。过快可能导致样品在膜上分布不均，过慢则可能导致Western转膜液不足，影响转移效果。通常建议转膜速度为10-20毫升/分钟。转膜时间：转膜时间也需要根据实验情况和转膜装置进行调整。通常建议转膜时间为1-2小时，但具体时间可能因实验所需而异。

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问质粒双酶切后无条带，目的基因有条带

loveliufudan

过夜12小时后双酶切后质粒DNA没有条带，但是目的基因有条带，这说明质粒DNA在双酶切过程中被消化掉了，而目的基因片段受到保护没有被消化掉。这可能是因为双酶切的条件不适宜导致的，比如酶切反应的时间太长、酶切缓冲液配制不正确、酶的浓度过高或过低等因素都可能影响酶切效率。建议重新评估酶切条件，例如缩短酶切反应时间、尝试调整酶切缓冲液浓度或酶的浓度等，以提高酶切效率。

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问EMSA只有DNA条带减少但不出现结合条带

王元杰7S75

您好，请问你后面解决了不出现结合带的问题了吗？

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问请教大家如何检测未表达基因的敲除/敲入效率

sswei

引入标记基因序列，便于目的基因的示踪和定位，或引入调控表达元件如增强子，调控目的基因的表达。

4 回答403 围观

问茜素红多聚甲醛存放

dxy_xextz7w2

我们一般都是染色后拍完照片然后加试剂再测一下吸光度值就报废了，不会再继续保存

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问构建过表达载体菌液测序出现问题

土井挞克树

因为通用性引物的特异性低，所以会出现重叠，更换引物再做

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问能告诉我在popgene这个软件里把等位基因从上图的数字换成用字母表示嘛

土井挞克树

直接从替换选项把基因的名称替换掉

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问酶切只出现一条目的带

汤姆卜丽波

可能是啊，你再用连接酶连一下验证一下

4 回答1870 围观

问噬菌体展示技术建库

huarenqiang5

自己建库的话比较难，要的时间也比较多，还是建议先生物公司合作比较省事。

3 回答502 围观

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