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        想问一下懂行的大佬,最近在用crisper cas9做基因的片段敲除,敲的是一株产油酵母里的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因。

        相关实验:全基因组CRISPR-Cas9基因敲除和转录激活筛选实验

        user-title

        老陈味

        想问的是:

        1、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因敲掉之后,菌还能利用葡萄糖吗?

        2、目前敲除效率非常低,假阳性很多,需要大量的筛选工作,想问一下有什么可以提高敲除效率的方法?例如:sgrna设计的位置、双sgrna之间的间隔这些等等…

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        3 个回答

        user-title

        huarenqiang5

        有帮助

        敲除效率受多方面因素影响,建议从以下几点考虑:

        1.基因敲除靶点应设计在起始密码子附近(包括起始密码子)或者起始密码子下游的外显子范围内。

        2.不同 靶点在基因敲除效率上有较大差异,因此同时设计构建 2~3 个靶点的基因敲除载体再从中选出敲减效果较佳的靶点。

        3.N1-N20NGG 靠近 PAM 的碱基对靶点的特异性很重要,前 7~12 个碱基的错配对 Cas9 切割效率影响较小。设计好的靶点序列应在基因库中进行 BLAST 检测。

        4.需要挑选成对的靶点。一般在正义链和反义链上分别挑选相距 20~30bp 的靶点配对。多对靶点的敲除效率常有较大差异。由于基因敲除实验时间长,在正式对目的细胞进行敲除前对靶点进行验证和挑选非常必要。

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因敲掉之后,菌只能无氧酵解

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        1.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是参与糖代谢途径中的一个重要酶,在酵母中起到催化葡萄糖-6-磷酸向糖醛酸转化的作用。如果敲除了G6PDH基因,可能会影响酵母对葡萄糖的利用能力,因为这是葡萄糖代谢途径的关键酶。但是,酵母可能会通过其他代谢途径来利用葡萄糖或者利用其他碳源,所以需要具体实验来检测是否会影响葡萄糖的利用。

        2.CRISPR/Cas9技术敲除效率受到多个因素的影响,例如sgRNA的设计、sCas9的浓度和细胞状态等。以下是一些可能有用的方法来提高敲除效率:

        sgRNA设计:在选择sgRNA时,需要考虑其在目标DNA上的位置、长度、互补性和靶位点的特异性。理想的sgRNA应该具有高特异性、较高的敲除效率和较低的假阳性率。还可以考虑使用CRISPR-Cas9在线设计工具,如crispr.mit.edu和zlab.bio/crispr等。

        双sgRNA策略:双sgRNA敲除策略可以提高敲除效率和特异性,因为两个sgRNA同时作用于目标位点,使其成为一个切口。但是,两个sgRNA之间的距离应该适当,太近或太远都可能降低敲除效率。

        优化Cas9蛋白浓度:Cas9蛋白的浓度也可能影响敲除效率。过高或过低的浓度都可能降低敲除效率。因此,应该通过实验来确定最佳的浓度范围。

        细胞状态:在进行CRISPR/Cas9基因编辑之前,需要确保细胞处于合适的生长状态,例如处于对CRISPR/Cas9基因编辑敏感的生长期。

        其他策略:还可以考虑使用化学剂或光刺激等方法,如使用Cas9和化学剂联合处理,或利用光敏Cas9和脉冲激光等光源来提高敲除效率。

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