免疫组化

免疫组化实验步骤

1.清理切片：石蜡切片置于65℃烘箱中烘片2h,将切片上的石蜡融化，取出切片，在切片上做好标记 将所要做的指标GLUT4写在切片上，将做好标记的切片放在玻片架上。

2.脱蜡至水：依次将装有切片的玻片架放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗。

3.PBS洗：将切片从玻片架上转移到修复盒内，并用PBS洗三次，每次5 min。

4.修复：将新鲜配置的EDTA修复液倒入修复盒内，用透明胶带将修复盒封好，将封好的修复盒放入微波炉中修复，调至中火至沸后断电，间隔10min后调至低火至沸。

5.冷却：将修复好的修复盒拿出来，打开盖子，自然冷却至室温，然后用PBS洗3次，每次5 min。

6.H2O2封闭：将配置好的浓度为3%H2O2溶液倒入修复盒中，盖好盖子，室温下避光孵育10 min。

7.画圈：将封闭好的切片用PBS洗3次，每次5 min，然后用组化笔将在玻片上画圈，将组织圈起来。防止加在组织上的试剂流失。

8.BSA封闭：将画好圈的切片甩干后放在湿盒内，在组织上滴加5% BSA封闭20 min，每个组织上滴加约100ul。

9.加一抗：甩去切片上的BSA液，不经PSB洗，每张切片加入约50μl用5%BSAl稀释的一抗（GLUT4稀释比：1:100）覆盖组织，放入4℃冰箱过夜。

10.复温：第二天早上取出湿盒，打开湿盒让切片在室温下复温30min。

11.洗去一抗：用PBS冲洗掉组织上的一抗，将切片放入修复盒内，用PBS洗3次，每次5 min。

12.加二抗：将切片从修复盒中取出，甩去切片上PBS液，放入湿盒内，然后每张切片加100μl用5%BSA稀释的二抗（稀释比：1:200），将湿盒放入恒温水浴箱37℃孵育50min。

13.洗去二抗：将湿盒取出，用PBS冲洗切片上二抗，将切片放入修复盒内用PBS洗3次，每次5min。

14.显色：甩去切片上PBS液，每张切片加50-100μl新鲜配制DAB显色液，在普通光学显微镜100倍视野下控制显色，显色完成用PBS将显色液冲洗掉来终止显色。

15.复染：显色完成后，将切片放在玻片架上用蒸馏水或自来水冲洗，用Mayer苏木素复染5min，自来水冲洗返蓝5min，流水冲洗。

16.脱水透明封片：将玻片架依次放入95%酒精I 5min -95%酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ5min -无水乙醇Ⅱ5min -二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

17.拍照选取视野：将封固好的切片晾干后，置于倒置显微镜用200倍视野选取视野，每个组织片选取三个200倍视野来进行统计分析。