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- 2025年12月04日
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武汉恒意赛生物科技有限公司
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Tunel细胞凋亡检测
Tunel细胞凋亡检测实验步骤
1. 依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗。
2. 切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37℃孵育15min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3. 切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育10min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4. 按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按1:9混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃水浴锅孵育60min，湿盒内加少量水保持湿度。
5. 将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片放入用甲醇配制的3%过氧化氢溶液，室温避光孵育20 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
6. 切片稍甩干后，每张切片加适量试剂3(converter-POD）覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
7. 切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，细胞核显色棕黄色为阳性，显色适度后PBS（PH7.4）冲洗切片终止显色。
8. 显色完全后，蒸馏水或自来水冲洗，苏木素复染，1%盐酸酒精分化（约1s），自来水冲洗，安水返蓝，流水冲洗
9. 将切片依次放入70%酒精5min-80%酒精5min -90%酒精5min -95%酒精5min -无水乙醇Ⅰ5min -无水乙醇Ⅱ5min -二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
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文献和实验一、原理与意义：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素biotinylate标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的链霉亲和素streptavidin特异性结合，后者又与POD底物H2O2、二氨
References [1] Danise P, Amendola G, Di CR, et al. Nucleated red blood cells and soluble transferrin receptor in thalassemia syndromes: relationship with global and ineffective erythropoiesis. Clin Chem Lab Med. 2009. 47(12): 1539-42. STABLE
的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。由此，TUNEL成为了检测DNA片段化(细胞凋亡)的最常用方法。(以TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒(增强型，绿色荧光)为例) TUNEL检测：使用20 U/ml Dnase处理Hela细胞10分钟。 二、TUNEL实验中关键步骤 1. 充分脱蜡和水化。脱蜡前可先将切片在 60ºC烤片 20 min，再使用二甲苯脱蜡2次，每次 5-10 min;而水化一般建议用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，便于后期试剂能充分、均匀的结合反应
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