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- 免疫荧光（双标）
- 2026年01月08日
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武汉恒意赛生物科技有限公司
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免疫荧光（双标）
免疫荧光实验步骤
1.石蜡切片置于65℃烘箱中烘片2h，脱蜡至水，用PBS洗三次，每次5 min。
2.切片置于EDTA缓冲液中微波修复，中火至沸后断电，间隔10min低火至沸。
3.自然冷却后PBS洗3次，每次5 min。
4.切片置于3%过氧化氢溶液中，室温下避光孵育10 min。
5.PBS洗3次，每次5 min，甩干后5% BSA封闭20 min。
6.去除BSA液，每张切片加入约50μl稀释的一抗（见附录1）覆盖组织，4℃过夜。
7.PBS洗3次，每次5 min。
8.去除PBS液，每张切片加50μl-100μl相应种属的二抗（见附录2），37℃孵育50min。
9.PBS洗3次，每次5min。
10.去除PBS液，每张切片加50-100μlDAPI染液，室温避光孵育5min。
11.染色后将切片放入PBS中洗3次，每次5min。
12.滴加适量的抗荧光淬灭剂于组织上，盖玻片封片，荧光显微镜下观察。
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文献和实验对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在 1h 内完成观察，或于 4℃ 保存 4h ，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2、每次试验均需设置以下三种对照： （1） 阳性对照：阳性血清+荧光标记物； （2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物； （3）荧光标记物对照：PBS +荧光标记物。 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是 donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti
问：神经干细胞nestin和EphrinA4的免疫荧光双标怎么做？答：过程和一般的免疫染色一样就是封闭的时候用两种血清混合封闭1：1加入一抗和二抗的时候也是混合加入但是因为稀释浓度不好掌握最好提前作预试~补充一点，荧光双标记必须选择的一抗抗性不同，如一个是兔多抗，一个是鼠单抗，那么二抗分别采用抗兔，抗鼠的不同颜色标记的荧光二抗即可。
固定和透化 在培养板中将已爬好细胞的盖玻片用 1 × PBS 浸洗 3 次，每次 3 min。 用 4% 的多聚甲醛固定爬片 15 min，1 × PBS 浸洗玻片 3次，每次 3 min。 0.5%Triton X-100(1× PBS 配制 )室温通透细胞 15 min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）, 1 × PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min。 封闭 吸水纸吸干 1 ×PBS，在玻片上滴加 5% 的正常血清（与二抗种属来源一致或相似），室温封闭 1 h
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