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- cDNA文库的构建是功能基因组研究的一种经济、快速、有效的途径，它为基因克隆、芯片制备、功能基因筛选等研究打下重要基础。天津赛尔生物采用SMART实验策略实现cDNA文库的构建,服务涉及RNA抽提、mRNA纯化、RT-PCR、同源重组、转化、文库评价等。
- 天津
- 2026年01月10日
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天津科斯莫生物技术有限公司
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cDNA文库构建
概述：
cDNA文库的构建是功能基因组研究的一种经济、快速、有效的途径，它为基因克隆、芯片制备、功能基因筛选等研究打下重要基础。天津科斯莫生物采用SMART实验策略实现cDNA文库的构建,服务涉及RNA抽提、mRNA纯化、RT-PCR、同源重组、转化、文库评价等。
技术原理及背景：
常规的建库需要在合成的cDNA双链两端通过连接加上相同或者不同的adaptor，用相应的酶切后可以插入载体中。由于连接效率低往往导致低丰度或者是较长的cDNA信息的丢失，使文库偏重高丰度和较短的基因，失去应有的代表性。在做表达文库时，如果cDNA的两端是同一个酶切位点，由于cDNA可能按两个不同的方向接入载体，反向接入载体的那些cDNA不能正确表达，因而有50%的可能丢失。然而用两个不同的Adaptor又会涉及双酶切以及双酶切是否完全的问题，影响产率。另外由于表达时3个碱基代表一个氨基酸，不同的表达框架会得到不同的产物，因此正向插入一个表达载体的cDNA只有1/3的可能得到正确的产物。虽然一度有ABC表达载体的解决方法，但是一段DNA同时插入3个载体的机会是有限的。
利用SMART技术建库，可以得到全长的cDNA文库，也不需要Adaptor的连接。这个试剂盒的SMART引物和CDS引物与前面的试剂盒略有不同，分别带有一个不完全相同的SfiI酶切位点。SfiI是一个在真核生物中极为稀少的酶，出现的频率要远远小于NotI、EcoRI等识别6个碱基位点的酶。SfiI识别序列为GGCCNNNN^NGGCC，中间的5个碱基为任意序列。因而两个引物分别带有一个不完全相同的SfiI位点就是说两个位点的中间5个碱基不同。这样经过SMART技术合成两端分别带有SMART引物和CDS引物的cDNA经过扩增后用SfiI单酶切，得到的是两端的粘端不同的cDNA，这样就可以定向插入特定的载体中，不会浪费50%的信息。
SMART技术的出现是一个新的里程碑。这个称作Switching Mechanism At 5’end of the RNA Transcript(SMART)，原理实际上非常简单：在合成cDNA的反应中事先加入的 3’末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到 达mRNA的5’末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成 的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利 用通用引物进行扩增。由于有5’帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDN A，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。
基本步骤：
1. mRNA的提纯，获得高质量的mRNA；
2. cDNA第一条链的合成；
3. cDNA第二条链的合成；
4. 双链cDNA的修饰；
5. 双链cDNA的分子克隆；
6. cDNA文库的扩增；
7. cDNA文库鉴定评价。
最终结果：
1. 产物电泳图谱；
2. 初始库；
3. 文库评价数据，包括库容量，插入片段平均长度，重组效率, cDNA完整性评价等。
注意事项：
样品需求量：组织（2～3克），细胞（108）,总RNA(200 ug)，mRNA(5～10 ug)，请务必保持样品新鲜，RNA无任何降解，以确保文库质量，请尽量提供物种基因组背景资料信息，如：基因组大小，基因平均长度等等。
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文献和实验,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。 cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。 原理 经典cDNA文库构建的基本原理：用Oligo（dT）作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接
by annealing the mRNA to oligo-dT loaded magnetic beads which will greatly facilitate the subsequent recovery of the cDNA products. In either case the next step is a reverse transcriptase treatment which gives rise to a socalled DNA/RNA hybrid. 5. Oligo dG
cDNA文库构建的过程分为六个阶段： 阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链 阶段2：cDNA第二链的合成 阶段3：cDNA的甲基化 阶段4：接头或衔接子的连接 阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDN 阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接 阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链 1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂
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