RNA pull-down实验

RNA pull-down实验是检测与目的RNA结合的蛋白质。使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。

一、实验流程图


二、实验流程
（一）质粒转化、涂板、摇菌
1. 取JM109感受态细菌80µl，加入1.5mlEP管中，用10µl枪头沾取质粒加入上述EP管中，混匀。
2. 冰上静置30min。
3. 42℃热休克90-120s1。
4. 迅速移至冰上静置2min。
5. 在超净台内，于上述EP管中加入50µl LB培养基（Amp－），37℃，160rpm摇床，增菌0.5-1h。
6. 菌液4,000rpm离心10min，弃大部分上清，将沉淀重悬，菌液全部加入LB平板（Amp+）上，涂布均匀，37℃倒置培养（过夜12-15h）。
7. 将37℃培养（12-16h）平板取出，于无菌操作台中挑取单克隆放入内含5ml LB培养基（Amp+）的15ml离心管中，于37℃、250rpm摇床增菌过夜18H,看菌液是否浑浊。菌液浑浊后进行质粒中提。
（二）质粒中提
（三）质粒线性化
（四） 琼脂糖凝胶电泳
（五）胶回收
六. 转录以及生物素标记：
1.取无RNA酶管，按下表操作：

1µg线性化DNA	xµl
Biotin RNA Labeling mix	2µl
10×Transcription buffer	2µl
RNA Polymerase	2µl
补足RNase-free水至18µl

2. 取出孵育好的EP管，加入2µl的DNaseⅠ，37℃孵育15min以除去体系中的DNA。
3. 取出上述操作的EP管，加入2µl0.2M EDTA（pH=8.0）终止反应。
4. 取1µg Biotin标记的RNA，加入适量Structure Buffer,使得RNA形成二级结构。然后将RNA 95℃加热2min，冰浴3min，室温静置30min。
5. 磁珠准备：使用RIP Wash Buffer 500µl冲洗磁珠3次。
6. 用50µl RIP Wash Buffer重悬磁珠，然后将其加入到生物素标记并变性的RNA中，4℃过夜。
7. 过夜的混合物3000rpm离心1min，去上清。
8. RIP Wash Buffer冲洗3次，切记将液体沿壁加入或者滴加，上下缓慢翻转混匀，切勿用移液器吹打。
9. 往磁珠-RNA混合物中加入细胞裂解液，裂解液中加入适量RNase抑制剂，室温放置1h。
10. 将孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物低速离心，上清回收，使用RIP Wash Buffer冲洗3次，1次1ml。
11. 于样品中加5×SDS上样缓冲液，95℃变性10min，跑SDS-PAGE凝胶。
12. 考染：取出SDS-PAGE凝胶于考马斯亮蓝染色液中，摇床过夜。次日用考马斯亮蓝脱色液脱色1~2h，中间更换几次脱色液至条带清晰，背景低为止。
13. 将目的条带切下送测序 (质谱检测、WB检测)。