外泌体miRNA测序

     外泌体（exosomes）是由细胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种直径约 30-120nm 的膜性囊泡。几乎所有种类的细胞都能分泌外泌体，并存在于人体各种体液之中，包括血液、尿液、唾液、乳汁、脑脊髓液等。外泌体含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能，参与免疫反应、抗原提呈、肿瘤转移、心脑血管系统、神经系统等生理和病理过程 。外泌体可运载不同种类的核酸，如 DNA、mRNA 和 miRNA，rRNA，snoRNA 等，其中 miRNA 受到最多的关注，由于它在基因表达调控上有着重要作用。miRNA 是一类 17-24nt 长的小的非编码 RNAs，是一类重要的 sRNA（small RNA，sRNA）。miRNA 通过与 mRNA 的 3’ UTR 或者开放阅读框 ORF 区域结合，能介导基因的转录后沉默，与细胞增殖分化、迁移、疾病发生和疾病进展都有关系。外泌体的脂质双层膜结构，能很好的保护其包被的 miRNA，使其可作为疾病诊断和预后的生物标志物[2]，影响肿瘤生长、增殖和转移。外泌体 smallRNA 测序可以得到不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下 sRNA 的表达情况，其中 miRNA、siRNA 以及 piRNA 是研究的热点，也是项目分析的重点。外泌体 smallRNA 测序可以找到不同样本间差异表达的 miRNA，也可以鉴定新的 miRNA。通过生信分析得到其靶位点所在基因的 GO 功能注释以及KEGG pathway 注释，最终可以得到外泌体 small RNA 在生物体中参与的生命活动的一个清晰的生物信息图谱。



1、实验方案
      测序策略：Illumina 平台  SE50
      数据量： 10M clean reads/样

2、技术优势
   通量高：一次测序得到上千万条序列；
   分辨率高：可以检测小RNA单个碱基的差异；
   精准度高：从几个到几十万个拷贝精确计数；
   可重复性好：深度测序保证了抽样随机性，重复性好，无需重复实验；
   检测范围广：既能鉴定已知小RNA，又能发现新的小RNA。

3、数据分析
3.1 标准信息分析
（1）按标准流程进行数据整理及数据质量评估；
（2）样品间的公共序列和特异序列分析；
（3）小RNA与参考基因组比对分析；
（4）按照优先级将小RNA进行分类注释
（5）Novel Small RNA预测；
（6）样本间miRNA差异表达分析；
（7）已知miRNA的家族分析；
（8）已知miRNA差异分析（≥2个样本）和聚类分析（≥3个样本）；
（9）已知miRNA和novel miRNA的靶基因预测；
（10）已知miRNA和novel miRNA的靶基因GO注释和KEGG通路分析；
（11）novel miRNA差异分析（≥2个样本）和聚类分析（≥3个样本）；
（12）差异miRNA靶基因预测；
（13）已知miRNA的碱基编辑分析；

3.2 高级信息分析
（1）snoRNA注释
（2）piRNA注释
（3）mir2disease注释

4、技术流程
5、参考文献
       案例（1）卵巢癌细胞通过基质细胞外泌体传递的miR21靶向APAF1获得紫杉醇抗性
       晚期卵巢癌细胞通常会发生大网膜脂肪组织处的转移，但是网膜基质细胞来源的分子对卵巢癌生长的影响还未见太多报道。本文通过二代测序技术发现肿瘤相关的脂肪细胞和成纤维细胞中miR21的表达量明显高于卵巢癌细胞。通过功能研究发现，肿瘤相关的脂肪细胞和成纤维细胞的miR21可以转移到卵巢癌细胞中，从而抑制卵巢癌细胞凋亡并通过结合一个新发现的靶mRNA—APAF1赋予其化疗抗性。这些数据表明，转移性卵巢癌细胞的恶性表型可通过从相邻网膜基质细胞来源的外泌体递送miR21来获得，抑制基质细胞来源的miR21可能是治疗转移性或复发性卵巢癌的一个新策略。  
       案例（2）外泌体miRNA可用于非小细胞肺癌的早期诊断
       该研究从早期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的血浆中分离肿瘤来源的外泌体。利用miRNA-seq对46个I期NSCLC患者和42个健康个体的外泌体miRNA进行分析，以鉴定和验证腺癌（AC）和鳞状细胞癌（SCC）的特异性miRNA。与健康个体相比，AC和SCC患者分别有11个和6个miRNA表达水平显著增高，13个和8个miRNA表达水平显著降低。不同的腺癌和鳞癌特异性的外泌体miRNA进一步被验证。与以前研究报道一致，miRNA-seq数据证实了可用于诊断NSCLC和其他癌症的潜在miRNA，如let-7、miR-21、miR-24和miR-486。结果表明，miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p为AC特异性的，miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b为SCC特异性的。采用AUC值为0.899、0.936和0.911，分别检测NSCLC、AC和SCC，评估三种组合miRNA组的诊断准确度。这些miRNA在用于早期NSCLC诊断并用于高度敏感的非侵入性生物标志物是非常有希望的。  
       案例（3）外泌体携带的miR-25-3p和miR-92a-3p能够刺激恶性脂肪肉瘤的发展
      尽管近年来已发展出针对脂肪肉瘤（LPS）的联合治疗方案，但大部分患者对这些疗法仅有轻微应答，并且可能导致局部或远端的肿瘤复发。早期检测到肿瘤的复发或转移可以通过早期临床干预来改善患者的预后。然而，目前还缺乏有效的生物标志物。该研究使用患者血浆和细胞系作为研究对象，证明了miR-25-3p和miR-92a-3p是由LPS细胞通过细胞外囊泡分泌的，可用作潜在的疾病诊断生物标志物。miR-25-3p和miR-92a-3p以TLR7 / 8依赖性方式刺激肿瘤相关巨噬细胞（TAM）分泌促炎细胞因子IL-6，这反过来促进LPS细胞增殖，侵袭与转移。该研究提供了新的LPS发展机制，LPS细胞与其微环境之间的通讯对LPS的发展具有重要作用。该研究揭示了循环miRNA可作为疾病诊断以及监测治疗效果的生物标志物。

参考文献
[1] Au Yeung et al. Exosomal transfer of stroma-derived miR21 confers paclitaxel resistance in ovarian cancer cells through targeting APAF1. Nature Communications, 2016.
[2] Jin et al. Evaluation of tumor-derived exosomal miRNA as potential diagnostic biomarkers for early stage non-small-cell lung cancer using next-generation sequencing. Clinical Cancer Research, 2017.
[3] Casadei et al. Exosome-derived miR-25-3p and miR-92a-3p stimulate liposarcoma progression.Cancer Research, 2017.