免疫组库测序

       免疫组库（Immune Repertoire，IR）是指某个个体在任何特定时间点其循环系统中所有功能多样性B淋巴细胞和T淋巴细胞的总和。T细胞和B细胞分别介导机体的细胞免疫和体液免疫应答，分别通过其表面的T细胞受体（TCR）和 B细胞受体（BCR）来识别和结合抗原，进而发挥功能清除病原体或体内肿瘤细胞。
       免疫组库高通量测序是通过多重PCR或SMART RACE法扩增TCR/BCR全长或CDR3区序列（主要是TCR的β链或BCR的重链），再结合高通量测序技术，对机体免疫组库的多样性及每种 T、B细胞克隆的独特性序列组成和变化进行分析，从而全面评估机体的免疫状态，明确疾病与T、B细胞克隆组成及变化之间的关系。随着免疫组库高通量测序技术的不断发展和成熟，基于免疫组库多样性变化特点的生物标志物发现、肿瘤等疾病疗效预测、疾病的易感性和抵抗性、感染性疾病及疫苗研究等方面都取得了重要进展。

1、实验方案
     测序策略： Illumina 平台 PE150
     数据量：1G raw date/样

2、样本要求
（1）分选的T或B细胞：建议细胞数10³-10⁷个，离心后保存于1ml Trizol中并混匀，低温保存运输。
（2）外周血单个核细胞（PBMC）：建议细胞数10³~10⁷个，离心后保存于1ml Trizol中并混匀，低温保存运输。
（3）新鲜全血：采集外周血于EDTA抗凝管内，混匀后取 250μl，保存于750μl Trizol LS并混匀，低温保存运输。
（4）组织：取50~100mg组织，保存于1ml Trizol中，低温保存运输。
（5） 如果客户自提 RNA，建议最好用进口试剂或试剂盒提取，最后溶于无RNA酶的水中。如果是分离的PBMC，RNA浓度大于50ng/μL，总量大于500ng。如果用组织提 RNA，浓度＞500ng/μL，总量＞5μg。 

3、技术优势
（1）拥有自主发明专利的UMI标记与校正算法(发明专利号：201810618023.7)，对PCR扩增与测序过程引入的错误与偏倚进行有效纠正，极大提高分析结果的准确度。
（2）采用当前免疫组库扩增最有优势的5' RACE法，保证结果的可靠性和后期研究的方便性；
（3）针对微量细胞样本（>100个），可以采用微量建库技术，大大提高建库成功率；
（4）由武汉大学、中山大学、南方医科大学以及美国斯坦福大学研究人员组成的专业的研究和分析团队，保证研究结果的可信度和可重复性；
（5）运用国际认可的专业的免疫组库分析模块，并结合我们自己独有的生物信息分析算法，所提供的标准化的分析流程即可满足科研或临床所需。另外我们还可提供数据的深度分析服务（需另收费）；


4、数据分析
（1）测序数据质量评估
（2）克隆的鉴定与计数
（3）不同V/D/J基因的计数、频率和频率检验
（4）不同V/D/J基因组合的计数、频率和频率检验
（5）有显著差异的克隆型频率
（6）CDR3长度分布
（7）CDR3氨基酸与核苷酸序列的克隆计数、频率和有关分析
（8）样本间CDR3氨基酸序列的相关性、相似性和多样性评估
（9）样本间共有克隆分析

5、技术流程


6、案例分析
      案例（1） 免疫组库测序揭示肝癌组织TCR多样性及其意义（由华银高通量完成）
      T淋巴细胞通过特异性T细胞受体（TCR）识别抗原肽，在人类适应性免疫应答中扮演着重要角色。TCR多样性与宿主免疫反应及肿瘤预后密切相关。尽管肿瘤浸润性T淋巴细胞对肿瘤预后有一定的影响，但很少有研究对乙型肝炎病毒（HBV）相关肝细胞癌（HCC）中的肿瘤组织和非肿瘤组织中的TCR多样性进行详细地特性描述。本研究对来自48位HBV相关HCC患者的肝癌肿瘤组织进行免疫组库测序。与癌旁组织相比，肿瘤组织CDR3氨基酸（aa）克隆型具有显著较高的平均数（2259 vs.1324，p＜0.001），TCR多样性显著升高（Gini协同系数，p＜0.001；Simpson指数，p＜0.01；Shannon熵，p＜0.001）。对中央Morisita-Horn相似指数（MHSI）的分析显示，在肿瘤组织与癌旁组织之间TCR库相似性较弱。本研究在肝癌患者肿瘤中观察到T淋巴细胞具有广泛的异质性，以及在相邻癌旁组织中有较高的HEC。肿瘤组织和癌旁组织中差异化T细胞库显示了乙肝相关性肝癌患者体内独特的T细胞免疫微环境。
       案例（2） 大规模t细胞受体测序阐明CD8+淋巴细胞在拉斯穆森脑炎中的致病机理
       拉斯穆森脑炎（Rasmussen encephalitis, RE）是一种罕见的儿科癫痫疾病伴随有半脑炎症和进行性神经系统缺陷。为了阐明RE的免疫反应过程，德国明斯克大学神经学研究所对RE患者的22例血液，2例脑脊液，和5例脑组织切片样本还有儿科样本参照进行T细胞受体（TCR）测序。RE患者样本表现为外周CD8+T细胞的扩散程度与疾病的严重程度相关。此外，在CNS中，RE是唯一的具有T细胞扩散的儿科癫痫疾病。同时提示在RE中，外周扩散的CD8+淋巴细胞的抗原特异性会侵害CNS，可通过限制其进入CNS来改善。  
       案例（3）个体遗传差异导致独特的淋巴细胞受体和抗原细胞
       适应性免疫系统的保护机体的能力是需要不同的淋巴细胞抗原受体完成的。然而个体差异基因和后天因素导致的差异和影响还没有被完全阐释。斯坦福大学医学院通过对5对同卵双生双胞胎的B、CD4+ T和CD8+ T淋巴细胞进行分析，来量化遗传因素在V(D)J重组过程和胸腺选择中的影响。选取PBMC进行RNA提取后利用反转录获得目的片段并构建免疫组文库，使用Miseq进行2x300 bp测序，最后分析免疫组库的差异性。
参考文献
[1] Chen et al. High-throughput T cell receptor sequencing reveals distinct repertoires between tumor and adjacent non-tumor tissues in HBV-associated HCC. OncoImmunology, 2016.   
[2] Schneider-Hohendorf et al. CD8⁺ T-cell pathogenicity in Rasmussen encephalitis elucidated by large-scale T-cell receptor sequencing. Nature Communications, 2016.                 
[3] Rubelt et al. Individual heritable differences result in unique cell lymphocyte receptor repertoires of na?ve and antigen-experienced cells. Nature Communications, 2016.