实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问如何最大限度地降低组织非特异性染色？

赵栋2012

1.缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。2. 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。3. 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色。4. 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果。5. 缩短DAB孵育时间或降低DAB浓

1 回答895 围观

问PCR 检测阳性，酶切无带的克隆，测序是否有结果？

tao0129

这种情况下，最好不要送去测序，最好重新做连接。当然这种情况的出现有一种可能是细菌培养时间过长，导致质粒被甲基化修饰所造成的。此时，你只需重新培养细菌，重新提取质粒即可。但这种情况的出现，还有一种可能是PCR假阳性，尤其是在克隆片段较短时会出现。那么这时，你只能重新做连接。建议：干脆重新做连接还比较放心。注意：你的片段比较小，你酶切后的片段浓度能否在电泳后出现带，这一点你一定要弄清，你必须保证浓度酶

1 回答3377 围观

问求问 PBS 的清洗方式选择、次数和时间的选择？

tao0129

1. 单独冲洗，防止交叉反应造成污染。临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。2. 温柔冲洗，防止切片的脱落。冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起切片将PBS对准切片冲洗，这样由于冲

1 回答2641 围观

问在做 PCR 时比较合适的扩增产物片段长度是多少？

赵栋2012

没问题，但要注意保真性，也就是用高保真的酶或者采用分段扩增的办法。如有必要有条件，就测序验证。引物设计与你的目的片断长度似乎关系不大，其序列的特异性则是很重要的。有很多常规提高产物特异性的办法，就不一一列举了如果受到模办的局限，不妨采用巢式PCR之类的办法。

1 回答4531 围观

问荧光定量 PCR 扩增产物能否直接进行琼脂糖凝胶电泳？

赵栋2012

确切的说荧光定量PCR产物跑凝胶看到条带说明你的产物很理想，但看不到条带不能说就没有产物，因为荧光定量PCR反应过程并不是严格意义上的循环扩增过程，因为大部分都没有退火温度。

1 回答6344 围观

问如何估计 RT-PCR 扩增产物的大小？

tao0129

你设计的正、反向引物的起止序列编号之差就是扩增产物的长度，如果一段使用oligo（T）就加上它的长度就可以了。

1 回答3263 围观

问为什么荧光定量 PCR 的扩增产物长度不能太长？

tao0129

你说的这种Real-time PCR应该是通过Taqman探针检测的。Taqman探针为基础的Real-time PCR以引物和探针序列决定反应的特异性，而通过荧光强度判断探针降解程度，从而推断模板量。

1 回答5883 围观

问PCR 产物电泳为什么都在 marker 最高的条带之上？

tao0129

这表示你的扩增不成功。解决方法：1. 是调整PCR体系的条件啦，看看你的试剂、试验参数有没有问题。2. 如果确信自己的PCR技术没问题的话，换一种引物试试看。如果另一种引物能够扩出来，那就是你的引物有问题啦！

1 回答1444 围观

问PCR 产物是否可以直接连到相应的载体上？

tao0129

1克隆产物应该用载体两端含有的引物进行鉴定。2. PCR产物是否可以直接连接到相应载体，要看你PCR用的什么酶。3.用Taq酶的产物末端自动加A，为黏性末端，可以直接连接；如果是用高保真酶，产物是平末端，必须进行磷酸化或者末端加A才能连接。

1 回答2267 围观

问内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？

赵栋2012

1. 一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10 min 左右；而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30 min。2. 用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片。3.现用现配，配好后4℃避光保存。

1 回答2433 围观

问扩增产物居然有很长的拖尾现象？

tao0129

使用Taqman探针做荧光定量PCR的产物一般都会做的很小，100 bp 多点吧，最大也不超过200 bp 的，你用的退火温度是50度，非特异扩增是不可避免的，即使引物的特异性很好，引物二聚体也肯定存在，而且大小和产物接近，所以在电泳的时候出现脱尾现象很正常。为什么扩增曲线会很好呢？因为使用了Taqman探针，只有特异性扩增产物会产生荧光，把引物二聚体和非特异扩增都屏蔽了，所以扩增曲线会很好！另外

1 回答1946 围观

问PCR 扩增产物如何保存？最多可以保存多久呢？

tao0129

放在-20度应该可以保存一段时间。即使放4度也可以放一段时间。酶切产物也可以放一段时间，如果只是跑胶的话，如果第一次跑的不理想，可以再跑一次。但如果做分子生物学实验，另说。

1 回答6452 围观

问一抗 4℃ 孵育后为什么要进行 37℃ 复温？

赵栋2012

1. 一方面，防止切片从4℃直接放入PBS易脱片。2. 另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4℃和37℃时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

1 回答4008 围观

问PCR 扩增产物浓度不够

赵栋2012

对于克隆所需，你可以多扩增几管，然后合并回收/浓缩。提高产物量建议：1. 如果你没有引物二聚体，建议你提高引物浓度试试。2.尽量降低退火温度。3. 鉴定用的话可以增加循环数，克隆的话就没必要了（<35)，循环数增加突变几率也会增加的。4. 如果你觉得模板浓度太高，可以降低浓度的，太高不好，引物正确配对的机会降低。5. 鉴定用可以考虑重新设计引物的，扩增产物长度不必太长200bp左右就行了。6

1 回答4083 围观

问苏木素复染后氨水返蓝这一步如何做、浓度多少、时间多长?

赵栋2012

返蓝可以用碱性溶液（PBS/Na2HPO4/淡氨水）或45℃温水、冷水蓝化均可。一般蓝化5~10 min。淡氨水有人用50 ml 自来水＋三四滴的氢氧化铵。

1 回答5654 围观

问免疫组化结果如何分析？

赵栋2012

1. 阳性着色细胞计数法。在40×光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。2.灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。3.评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（

1 回答2666 围观

问如何把握 DAB 的显色时间？

赵栋2012

1. DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗。2. DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间。3. 此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间。4. DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能

1 回答2310 围观

问通过 PCR 扩增出来的目的基因有粘性末端或平末端吗？

tao0129

常规Taq酶PCR产物3‘端带A，为粘性末端。高保真酶如PFU之类的PCR产物为平端。详见你使用的Taq酶说明。

1 回答2265 围观

问PCR 扩增产物于引物区会发生移码突变吗？

tao0129

一般来说测序在最开始的20个碱基是不太会有好的峰型的，但是如果你几次测序都是这个结果，那么就应该是引物合成的问题了。一般生工默认的合成引物会有三种纯化方式，PAGE胶纯化，过柱子和HPLC，三种的价格是PAGE另外，你的酶切位点与突变的位点不在一个位置，所以由于酶切造成的可能性不是很大，但也不能排除这个原因。

1 回答3037 围观

问如何把握苏木素复染时间？

tao0129

1. 苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。2.; 盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。3. 如果分化的颜色过浅，可以复置于苏木素中染色。

1 回答2287 围观

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