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实验问答

31,477,045 科研人在看

问请问 PCR 程序最后给出的 RQ 值是否可以直接用来统计？

qianliu185676911

PCR反应中,CT值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数；RQ值是比较的Ct值。它经过数学公式变形而来。它是判定实验样品中目标靶位点与在标准样品中相同靶位点的表达变化情况。

1 回答7162 围观

问请教几个问题，大鼠在颈总动脉给药后，拔出针头后必须结扎该颈总动脉吗？这之后能够存活吗？

ahan

如果是直接在大鼠体表进针，需消毒好进针部位，进针后可以直接按压，按压时间5-15分钟，自己摸索。如果是大鼠劲总动脉暴露后给药，可能需另当别论。个人之见，仅供参考

1 回答1579 围观

问关于 PHA 刺激 PBMC 增殖，用 CCK-8 检测，实验孔 OD 值却不稳定是为什么？

roby_0_0_2000

你的PHA-p 5ug/ml就可以了，浓度大了自然会死。死于过度刺激。还要加IL-2，不加会死的。

3 回答4695 围观

问免疫组化结果与文献相反是为什么？

yqc127

这可能要从两方面考虑：1. 自己的主观原因，可能是自己实验操作的问题；如果自己的问题感觉不大，也可能是抗体特异性的问题，可以看看有没有相关的文献也用了类似的抗体，进而一步步查找问题。2.标本的客观问题，由于不知道有没有可能你的标本是一个有别于文献报道的特例？还是文献报道的情况是有限制范围的？这要自己斟酌。即使是同一样本，由于存在取材，保存，处理等多方面的差异也可能导致最终的结果的不同。

3 回答3999 围观

问目的基因mRNA表达量一定会比GAPDH低吗？

tntztyx

可以在NCBI看一下spc的基因表达特异性

2 回答3279 围观

问常用的蛋白纯化技术有什么？怎么在大肠杆菌、细胞中进行表达？

我是金博士

根据你想要表达的蛋白，查找基因，构建到原核载体上，在大肠杆菌中表达，然后进行纯化。

1 回答2476 围观

问原核表达在包涵体里，该这么提蛋白做纯化呢？

丕龙兄

1.蛋白在包涵体里很常见，原因也很多，你可以尝试一下其他的解决方案。比如说降低诱导温度，更换表达载体（GST标签有增溶作用，pCOLD低温表达载体…），更换表达菌株；2.如果上述尝试还是不成功，那就只能变性纯化了，用变性剂（如6-8M尿素）溶解包含体，然后过镍柱，这样可以得到大量蛋白，纯化出的蛋白通过透析进行复性，然后测酶活。3.复性的蛋白酶活跟所用的复性缓冲液有很大关系，查文章，用他们的实验方法

1 回答3785 围观

问阳性克隆检测PCR问题

过客一名

要不用M13引物或你的引物A或D去测个序，看看究竟连接的片段是什么？

2 回答1331 围观

问Native Page 为什么样品的下段都不见蛋白条带？

我是金博士

你的胶做得不太好啊，marker都分不开。你要是想知道条带少，是上样量少了还是降解了，可以做个上样量梯度，一般都会做个预实验，看看浓度。

1 回答2769 围观

问关于用 cre 小鼠和 loxp 小鼠获得条件敲除小鼠的问题

tntztyx

cre 采用的是calcium/calmodulin-dependent protein kinase IIalpha promoter ，启动活性就由CAMKII的启动子决定，与基因组中camkII的启动活性类似，当然有表达特异性可能有变化，毕竟是模式改变的转基因动物

1 回答9322 围观

问新手求解答

我是金博士

1：用内参照是为了评价你的各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，所以用他们来作为你加样量的对照。这样western结果中你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或是人为造成目的条带浓度的变化。严格意义上说，内参事必须做的。

1 回答878 围观

问假如模板DNA中混有杂蛋白是不是就扩增不出来

我是金博士

你的DNA模版是怎么提取的呢？有没有进行过处理？扩增没成功，有很原因，杂蛋白的影响也要看情况，一般试剂盒都能去掉的。

1 回答1991 围观

问WB 实验中如何运用凝胶成像系统照相？加完二抗用 TBST 洗之后该做什么准备？

a5055778

洗完膜加上显色体系后，放在塑料薄膜里，轻轻推去气泡，然后直接放到照相系统里照相就可以了，系统会让你选多久曝光一次和照几张相，我一般选1min-5min/5-10张；假如你选1min一次，共照5次，那么总共就是5min，选一张最好的。复制下来再用CS analyzer之类的反色输出图片就行了。

1 回答2486 围观

问PCR产物用来跑电泳跑不出条带

我是金博士

要么胶有问题，可以同时做个参照，要么PCR不稳定，也很正常的，P不出来就要重新设计引物了哦

1 回答1920 围观

问PCR最低反应体系

我是金博士

你为啥要5μl体系呢？理论是引物和模版按比例啊，这样不太好操作呀，不符合常规呢。

1 回答2348 围观

问连接后切不开

我是金博士

之前能切开吗？在你构建之前，要对载体进行双酶切处理的，那个时候如果能切开，后来也是可以切开的。实在切不开可以尝试分布酶切，或者检查下酶切条件、限制性内切酶是否失效。

1 回答1376 围观

问PCR各反应体系中模版DNA和引物的量分别是多少？如何确定的？

我是金博士

1、不建议你配好再分装，都不这么操作的，你可以做20ul体系的。2、模版和引物都是有浓度要求的，然后根据浓度、体系进行计算的，具体请查看本实验，或者看分子克隆那本书，有明确写的。

1 回答8325 围观

问分泌蛋白量比较少且培养基中盐离子很多的情况下，如何能快速达到除盐和浓缩的目的？

xzw113

可以在血清饥饿后加入叠氮钠0.1%，防止蛋白降解，也可用cooktail，这个比较贵呵呵。然后用蛋白浓缩管富集milipore 有买的买10kd富集的就可以

1 回答5039 围观

问3'RACE 的时候对 oligo（dT）长度有没有什么要求？

yong8hu

不能太短，否则杂带很多，我们常设计27-29bp,设计2-3条，退火>65度。用的试剂盒对成功与否很关键，你的mRNA也是主要因素，保证没有降解。还要考虑基因表达丰度的问题。

1 回答1799 围观

问为什么一定要加內参？有的样品里如尿液中蛋白分析无合适內参怎么办？

alaling

加入内参是为了消除外部操作产生的差异。比如你需要加样1ul，你能保证枪加入的就一定准确的是1ul吗？枪尖随便挂个0.1ul和不挂，差别就有10%。尿液里的蛋白如果没有合适的内参，可以考虑以添加外参的方式进行，就是在每个样品里面添加已知量的某种纯蛋白。当然，如果用纯体积或纯样品量进行参比也是可以的。最重要的是要参考文献，看看大部分人是如何处理这种问题的。

1 回答1904 围观

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