实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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细胞

问如何解决容量瓶刻度上方液体沾壁问题

今天摆烂了咩

1.容量瓶清洗至无水珠挂壁，晾干备用2.定容时候悬空3.滴加之后可以静置片刻

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问如何减少免疫组化的非特异性染色

府宅

(1)可以选择购买高质量、高纯度的荧光素二抗。（2)延长血清封闭时间。(3)调整一抗和二抗孵育条件和浓度至。(4)一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。

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问免疫组化实验中购买的抗体试剂建议浓度在预实验中效果不好，如何调整浓度能节省抗体和实验周期

dxy_gwrp7ndq

为调整到最佳浓度，可进行预实验，通过滴定测试确定适合自身应用的最佳抗体工作浓度

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问做小鼠脾脏的胞内因子分析时，应该用什么刺激阻断剂，适合与IL-6和IL-1β的检测？

府宅

可通过收获3天巯基乙酸盐诱发的腹膜细胞，并用1μg/ ml LPS和GolgiPlugTM刺激4小时

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问请问做肿瘤的免疫组化实验，需要阳性、阴性对照吗？

小布丁瑶瑶

免疫组化阴性对照一般是需要做的，但是也不是每一种检查都需要做阴性对照的，如果检查不常用的抗体就需要做阴性的对照，如果是常用的抗体就不需要做阴性对照了，只需要做阳性对照就可以了。

3 回答529 围观

问爬山细胞怎么做免疫组化，HE染色技术，详细步骤，谢谢师兄师姐。

dxy_gwrp7ndq

HE染色：（1）先将长有细胞的六孔板用PBS洗3次（2）将六孔板浸入95％的酒精固定15分钟（3）PBS洗2次，每次1分钟（4）浸入苏木素染液，染色5分钟（5）自来水浸洗（6）浸入稀盐酸酒精进行分色，数秒即可（7）自来水浸洗（8）浸入淡氨水中，使胞核蓝化，3分钟（9）自来水浸洗（10）浸入伊红染液，染色6分钟（11）自来水浸洗（12）依次经过70％、80％、90％酒精各1次，95％酒精2次和100

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问请问用CD24-FITC CD44-APC标记肿瘤干细胞用流式检测的时候群体会移动是怎么回事啊，同一个样品先后两次上样群体

Timy最爱柠檬水

如果一批细胞需要重复多次流式检测，最好使用多聚甲醛进行固定，这样才能排除细胞因离体后出现再分化的情况。与此同时，应该在再次检测的时候重新调整电压。

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问同一管稀释后的一抗，跑不同批次的同种处理的样品，条带由单条带变成了多条带，操作是没变的，就只有样品批次不同，是怎么回事呢？

颜渊溪桥

如果抗体稀释液不是反复用过的，如果两次跑胶操作没问题，如果样品没有降解，那可能是个实验现象嘞，主要是得看同样没问题的操作下重复的结果。

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问请问用断颈法处死符合伦理吗？按这种方法做实验投稿会有影响吗？

txs900416

符合伦理，但要在中度麻醉下进行断颈，不能直接断颈，伦理过不了

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问免疫荧光染色实验中，有时用甲醛进行固定时间较长可以得到更好的染色，有时较短染色效果更好，请问固定时间与蛋白质种类是否存在联系？

txs900416

取决于目的蛋白的性质，有时候固定时间太长，细胞膜表面分子容易变性脱落；有时候固定时间太短，固定不完全，染色效果不好

2 回答726 围观

问免疫荧光共定位量化一般采用哪个系数？

简单最重要666

皮尔逊相关系数和及重叠系数。两者作用关系仍然有所不同

2 回答2594 围观

问染色细胞质不清晰的原因是什么？

颜渊溪桥

如果你说的是荧光染色，除了实验操作外，一个可能是抗体特异性不够，另一个可能是细胞比较圆，不是很适合做染色观察，实验目的允许的情况下可以换成比较铺展的细胞做。

3 回答704 围观

问体外泛素化实验杂不到泛素修饰条带怎么回事呢

西柚味的芋圆

这个可能有多种因素的原因。先要看看抗体是不是有效，其次你的细胞有没有进行泛素化的过表达，然后是不是带标签的。还有加入mg132的时间可能需要摸一下。时间是关键，我的细胞泛素化发生的太快了，

1 回答1072 围观

问流式细胞术检测NK细胞杀伤功能，如何精确检测杀伤效率。

txs900416

NK92细胞的杀伤功能取决于NK细胞的细胞状态及靶细胞的细胞状态，建议将细胞状态调整到一致再做重复实验。此外，合理标记靶细胞（例如使用CTV或CFSE染料）进行合理的靶细胞圈门可以区分效应细胞和靶细胞。杀伤时间和效靶比都需要预实验探索

2 回答1405 围观

问Western blot 中背景强

颜渊溪桥

1%t tween+5%peptone tbst/pbst 配置，室温封闭1h,铅笔标记下marker，会洗没的；含0.1%tween上抗体。

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问ELIISA全菌包被检某个蛋白的时候，阴性对照特别高，怎么办

郭郭的郭郭

ELISA的前带效应。前带效应（或后带效应）其实是由测量程序的固有属性产生。对于所有测量程序而言，都有分析测量区间（analytical measurement interval，AMI）这一个重要属性。两个思路：1. 优化测量程序，拓宽AMI，通过提高原料用量或者改进包被工艺，使目标浓度进入AMI以内；2. 建立稀释方案，通过稀释使目标浓度降至分析测量区间以内，再对其进行检测。第二种思路其实是在

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问流式细胞术单细胞悬液制备如何获得更明显的分群？

txs900416

T细胞染色要看T细胞的富集程度，例如淋巴器官中，若不分群，主要考虑细胞量过大抗体量不足；若TIL或者其他组织中来源T细胞，还需要考虑细胞分离不好、T细胞丰度较低的因素，建议去除实质细胞背景，加染白细胞标志CD45，圈出cd45阳性细胞群再分析。

4 回答2630 围观

问免疫组化什么表现会出现假阳性结果？抗体是既往文献中使用过的抗体，纯度应该没问题，染色较深，该分析有无假阳性可能吗

txs900416

一般假阳性出现在pbst洗得不够干净，抗体特异性不够好，组织背景高，曝光时间过长等。建议做一张只染igg的isotype以区分是否为假阳性

3 回答658 围观

问大鼠中酶联免疫吸附试验的血清用量是多少？

txs900416

取决于检测的目的蛋白含量和试剂盒的检测限，例如用klh免疫大鼠，测igg和igm就需要进行十倍和百倍的稀释，对照组则不用稀释；例如测血清中细胞因子，基本不用稀释，可用原液测。一般使用96孔平板加入的稀释好的样品体积为200ul。

2 回答508 围观

问关于免疫组化中染色不均的问题出现花斑样染色，大小不均，部分连成片，该如何考虑？

txs900416

可能是1、封闭不完全；2、抗体浓度太高，导致区域性结块染色；3、pbs洗涤不完全，导致过量抗体的非特异性结合

3 回答699 围观

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