实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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细胞

问用脱氧胆酸去干扰是直接加进去吗？浓度是多少呢？

dxy_gwrp7ndq

直接加入，脱氧胆酸的纯度为至少96%

1 回答358 围观

问IPTG诱导蛋白蛋白表达不出来

府宅

建议可以尝试改用酵母或者昆虫细胞表达。甚至直接用哺乳细胞表达。如果一定要用BL21表达，我的建议是尝试用较低浓度IPTG在较低温度比如室温下表达更长时间，温和的表达条件运气好的话能稍微让蛋白质没那么容易misfold，不过不要抱太大希望。如果还是表达不出来，截短蛋白到70kDa左右。专注于一部分蛋白

2 回答3334 围观

问WB条带不均一，颜色一半深一半浅是怎么回事？

whilt-shirt

有可能是发光液没加好，也有可能是转膜时问题，还有可能是抗体敷育时条带未完全浸泡在抗体稀释液里面

3 回答4450 围观

问蛋白质样本提纯总是不达标，怎么提高提纯纯度？

dxy_gwrp7ndq

1、延长裂解时间，并且反复吹打，10min吹打一次。2、改变方法：用细胞刮刀将细胞刮下，离心收集细胞，在离心管里裂解细胞（如有超声，可以加超声）

2 回答496 围观

问组织负八十保存后还能进行免疫组化检测吗？实在没有其他样品的情况下，怎么样尽量避免冰晶的影响？

whilt-shirt

可以的，只是组织结构会有些影响，可以考虑采用冰冻切片机切片，然后进行后续的步骤

1 回答377 围观

问蛋白质印迹细胞提取液问题？

dxy_gwrp7ndq

也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。

2 回答464 围观

问SLE中Sm抗体为何检测率这么低？

dxy_gwrp7ndq

抗 Sm 抗体在 SLE 中特异性高,但敏感性低

1 回答408 围观

问提rna的同时怎么把蛋白也提取出来？

bamboopiggy

有kit可以，酚氯仿抽提后，上层是rna，中间的白片是dna

3 回答981 围观

问跑胶的时候总是跑不好，有拖尾现象，怎么样才能避免呢？

bamboopiggy

配胶的TAE要用带rna酶清除剂的水配，跑胶的也是如此

5 回答1873 围观

问电泳的拍照后有阳性显示两条条带是什么原因？

dxy_gwrp7ndq

原因；样品分解，一抗特异性不好或者浓度太高，PVDF膜封闭不够彻底，抗体没有四度过夜，或者上样品太高等

2 回答993 围观

问探针法pcr低浓度模板复孔之间的差异大，除了加样问题还有什么原因会导致？

府宅

分装试剂时是否混匀，加模板时是否有挂壁

2 回答386 围观

问多重pcr是将配好的已优化好的单重体系等体积混合，还是将各引物对和探针按优化后的比例依次加入buffer和酶中？那种方法比较好？

dxy_gwrp7ndq

按优化好的比例依次加入，这样可以不断调整反应条件，直至最佳反应条件

1 回答428 围观

问蛋白组学微量样本如何测定？

dxy_gwrp7ndq

可以利用纳米级的液相色谱串联质谱，能同时鉴定并定量少量组织样品中的数百个蛋白。

1 回答554 围观

问实时荧光定量PCR反应

dxy_gwrp7ndq

两步法，三步法并没有本质区别，信号的读取都是在每一个延长结束后读取。定量PCR一开始的时候也是三步法的。两步法，是因为设计引物的时候把退火温度设为酶的工作温度，而且定量PCR的产物都很短，需要的时候都短，所以两步法更方便。三步法的话，花的时间长，不利于快速实验。

2 回答874 围观

问细胞经常染支原体怎么办，也在用杀支原体的药，就是经常反复

府宅

1）药物辅助加温处理：先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在 41℃ 培养 18 小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。2）免疫反应清除法：主要包括有动物体内接种除菌法和体外吞噬细胞吞噬法，前者是把受污染的细胞接种在动物皮下或腹腔中，借动物免疫系统消灭支原体，而细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出细胞再进行培养繁殖；而后者从动物腹腔采取巨噬细胞并对其进行纯化，加入被污染的细胞培养液

2 回答635 围观

问多聚甲醛固定与丙酮固定的区别？

Amor良

1、这两种方法基本效果都还可以。但要注意多聚甲醛固定时间长的话，一定要防止抗原被醛基封闭决定族。2、其实，丙酮的作用原理是溶解膜磷脂，所有的脂质双层（胞膜、核膜、细胞器膜等）将被破坏，但蛋白和多糖类不受影响。而丙酮固定后不需进行抗原修复，它是一种非交联固定剂。3、多聚甲醛固定对酶类和脂类保护的好，易与蛋白发生交联，所以一般经过甲醛或PFA固定后的标本一般需要抗原修复。

3 回答4765 围观

问RNA提取没有沉淀是什么原因？

wuli猫宁

有时候看不到沉淀，说明你用的细胞或组织太少，RNA比较少，亦或者RNA不低，但看不到沉淀，可能离心时RNA没聚集在一起，散贴在管壁！对于这两种情况，不要灰心，实验不一定失败！取15ul的无RNA水（不要太多），把管壁好好洗洗，RNA就会溶解在水里，一般情况，RT后，也足够做好几次实验了！

3 回答2158 围观

问何为基因工程抗体？？

dxy_gwrp7ndq

目前在临床试验中基因工程抗体约占生物制剂的30%。重组抗体的体积越来越小，或被重新构建成多价分子，或与其它分子相融合，如放射性核素、毒素、酶、脂质体和病毒。重组技术的出现使筛选、人源化、抗体的生产得到革新，并取代杂交瘤技术，从而使以抗体为基础的药剂设计成为可能。

2 回答577 围观

问为什么蛋白电泳时不需要加冰，而转膜时需要？

whilt-shirt

电泳时用恒压，一般先低压（60或80V）后高压（120或150V），这时候对应的电流不高，一般最高都不超过100mA，而转膜时一般用的恒流（300mA），高电流通过自然产热量就大了

2 回答3005 围观

问关于融合蛋白纯化的问题？

Amor良

1、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。2、不要太稀，蛋白浓度维持在μg/mL～mg/mL。3、合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的缓冲溶液pH避免与pI相同，防止蛋白质的沉淀。4、使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解;在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解DNA，防止DNA对蛋白的污染。5、避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性。6、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。7、在缓

2 回答462 围观

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