3 个回答
dxy_gwrp7ndq
AMV在高反应温度时可消除mRNA的二级结构对逆转录的阻碍
迟C迟
若要获取全长RNA的反转录，那么RNA二级结构的问题就不可忽略，因为反转录酶在遇到此类结构后会终止反应或从模板上脱落下来。
也许你很难判断RNA是否具有二级结构，但如果基因中GC含量较高，通常意味着RNA很难被变性且不可能是单链，此时就需要在65℃ 5min对其进行充分变性，以避免其对实验结果的影响。
另外，还有一种方法可解决此问题，即使用一种最适温度高于正常标准（37℃-42℃）的逆转录酶。比如来自Life Technologies的Themoscript酶就常用于具有复杂结构RNA的逆转录。当然也存在一些即使在常规逆转录温度（37℃-42℃）的条件下，也能跨过RNA二级结构的高效率逆转录酶，即使是针对富集GC序列的RNA也能得到很好的结果。
dxywode
在进行反转录的过程中，当引物延伸到有二级结构的地方，反应就会被迫终止，影响cDNA的合成长度。此时可建议先将模板进行65℃孵育5min然后迅速冰上冷却使二级结构变性；同时可通过在较高的温度下（如55℃）反应以降低RNA二级结构的形成。
相关产品推荐
EnzymoPure™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)，EnzymoPure™, 不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶，可以满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。，阿拉丁
￥509.90
EnzymoPure™ M-MuLV反转录酶，EnzymoPure™, 不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含BeyoRT?M-MuLV反转录酶本身含有的RNaseH酶活力以外的RNA酶，满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。，阿拉丁
￥269.90
EnzymoPure™ Q M-MLV反转录酶；阿拉丁EnzymoPure™, 不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶，可以满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。；阿拉丁
￥183.90
EnzymoPure™ III M-MLV反转录酶；阿拉丁EnzymoPure™, 不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶，可以满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。；阿拉丁
￥195.90
EnzymoPure™ II M-MLV反转录酶(RNase H-)；阿拉丁EnzymoPure™, 不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶，可以满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。；阿拉丁
￥164.90
相关问答
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
