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科研学霸天团,48小时有问必答
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蛋白质粉的定量测定实验步骤
wuli猫宁
蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一目前常用的有两种古老的经典方法,即酚试剂法和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法。其中酚试剂法和考马斯亮蓝法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍。。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花
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病毒反向遗传操作的比例是如何确定的?
dxywode
RNA病毒的反向遗传学操作是指由病毒的cDNA克隆获取RNA病毒的一项技术,该技术通过人为加入的DNA环节,实现了在DNA水平上对RNA 病毒基因组的人工操作,在深入阐明病毒基因组结构与功能、发展新型病毒载体,尤其在研制筛选候选疫苗株等方面有很好的应用前景.用PBS液洗3次,按照1:6比例。
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细胞分选单克隆之后一般多少天能长起来呀?
丁香粉猪猪
干细胞填充后,通常需要3-4周开始增生,3个月左右达到最佳效果。
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问
肺癌切片免疫组化的结果如何判读
dxy_gwrp7ndq
主要依靠其免疫组化作为重要的诊断依据,TTF-1、 NapsinA、CK7阳性,提示是肺腺癌。P40、P63、CK14阳性,提示是肺鳞状细胞癌。CgA、Syn、CD56阳性,提示是肺的神经内分泌肿瘤。上述所有的神经内分泌标记、腺癌的标记和鳞癌的标记都是阴性,则提示是肺的大细胞癌。判断免疫组化染色为弥漫强阳性的标准为,大于等于10%的肿瘤细胞阳性,信号定位准确,且被染成黄色或褐色颗粒。局灶阳性或弱阳
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问
人肿瘤抗原的识别需要注意什么?
dxy_gwrp7ndq
收集细胞要迅速 ,低温下进行,以减弱蛋白酶的作用
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问
病毒感染和CRP的关系是什么,降低是不是就算愈后良好?
府宅
在病毒感染时,没有显著提高,通常≤50mg/L,如果 CRP 值显著下降,证明疗效良好。
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问
导致实时荧光定量 PCR 效率低有哪些原因?
dxy_gwrp7ndq
1. PCR反应性能差。引物、试剂、PCR条件的再摸索。优化反应条件,或者重新设计PCR引物。2. PCR阻害物质的混入。模板提取方法的再摸索。3. 标准品稀释不准确。使用专用标准品稀释Buffer。
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问
单个目的蛋白抗体显影后出现两个条带一般是什么问题?
dxy_gwrp7ndq
1.非特异性的分子量偏大条带之一可能是目的蛋白在SDS PAGE出的问题出了问题,另外两个带可能本来就是杂带了。可以回收后对条带用质谱检测精确的分子量加以确定。2.非特异性的分子量偏大条带至少应该有杂带,杂带出现而且与一抗相互作用,那么只能说杂带的顺序表位也能被一抗识别,必须更换专一性更高的抗体。3.还有考虑你的镍柱亲和分离的问题,是不是获得了你的需要的目的蛋白质。
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问
做间接法荧光免疫染色,如何设置对照?
府宅
(1)空白对照:如果你做的是石蜡切片免疫组化,这个对照必须有,目的是看自发荧光,脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。(2)阴性对照:标本直接滴加二抗,呈阴性反应。(3)抗原对照:标本加同种动物的未免疫血清,以PBS冲洗后,在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体,应呈阴性反应。
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问
免疫荧光我想染3种蛋白 我有红兔和绿鼠还应该买什么的抗体
dxy_lkpxue5w
看你一抗用的什么种属的抗体,如果你3种同时染的话,可以买个除兔、鼠来源的一抗,然后买个抗这个种属,其他荧光通道的二抗,也可以是这个蛋白的其他荧光颜色的直标一抗,但是染的时候这个直标一抗最好最后染,因为一抗来源如果跟前2个抗体一样的话,容易造成假阳性;如果两个一起或分开染色,只要一抗来源是不一样,用的二抗颜色不一样就好了
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酶联免疫封闭剂可以用纯生物素吗?不封闭对结果有影响吗
府宅
不可以用纯生物素,一般是使用生物素标记抗体,它和酶的标记率高,又不影响蛋白的活性。
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为什么预选实验跟实际有差距
迟C迟
这个同学,你首先得了解预实验,预实验不等于正式实验,一切结果以正式实验为准。如果实验不可重复,除了考虑操作原因,可能也得考虑课题设计初衷。
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问
请问为沉默效果较好,si-RNA应在细胞汇合度多少时添加为宜?
迟C迟
提前一天将细胞种植在24孔板中,以转染时细胞汇合度(Confluence)在30%左右为宜。
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WB条带灰度如何分析,数据如何处理?
府宅
比较简单的综合性质图像处理软件ImageJ可以很方便的进行灰度分析,而且ImageJ是免费软件,可以在其官网直接下载使用。
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对于荧光直标抗体,如何设计实验对照?
小布丁瑶瑶
1、直接法 (1)标本自发荧光对照 标本只加PBS或缓冲甘油封片,荧光显微镜观察组织内如果有荧光,称为自发荧光。 (2)抑制试验 可分为一步方法和二步方法。 一步抑制方法:先将荧光抗体与过量未标记特异性抗体作等量混合,再加在标本上染色,结果应为阴性。 二步抑制方法:标本先加未标记的特异性抗体,水洗后再加标记荧光抗体,结果应呈阴性或明显减弱的荧光。 (3)阳性对照 用已知阳性标本做直接法免疫荧光组织
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问
怎样保证细胞裂解充分从而保证全部DNA被提解出来
bqejjh123
建议可以用热休克法和超声波处理法
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问
如何提高RNA得率?
府宅
1.避免RNA酶污染:微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮肤,头发,所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等,此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。2.健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。3.针对RNA制备方法以及靶细胞类型的不同,选择好的转
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问
所用缓冲液的体积由哪些方面而定?
丁香粉猪猪
只要知道缓冲对的PH值,和要配制的缓冲液的pH值(及要求的缓冲液总浓度),就能按公式计算盐和酸的量。总结出pH值与缓冲液对离子用量的关系并列出了表格。只要知道要配制的缓冲液的pH,经查表便可计算出所用缓冲剂的比例和用量
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问
细胞培养需要注意什么?
迟C迟
首先注意观察细胞培养液的颜色。 现在的细胞培养液通常都放有酸碱指示剂(绝大部分是酚红)。 细胞在培养生长过程中,不断在培养液上清中累积酸性物质,时间长了,培养液变为黄色(同时培养液中营养物质耗尽)。 其次镜下观察细胞的生长状态是否良好,是否需要传代。 如果生长状态不好,需要对培养液进行调整(一般是加大 血清 浓度)。 过于密集出现大片融合或太密集而导致细胞脱落,则进行传代。 如果长势良好,且细胞培
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问
请问一下,有人做过 羧化的TPGS与TEMPO发生酰胺反应吗?我采用的是EDC做催化剂,DMSO做溶剂,不知道为啥合不出来?
dxywode
根据反应的机理,是edc和hobt先和酸反应,然后是胺进攻而生成最终的产物酰胺。我认为最好是先加rcooh和edc、hobt让他们反应半个小时后。再加入胺。你也可以加点dmap,我认为它一方面是催化剂,另一方面它也起到了提供碱性的作用。我们实验室的经验是1当量酸+1当量edc+0.5当量dmap+1当量hobt,反应半小时后加入1.2当量胺,然后室温搅拌tlc跟踪反应。这种类型的反应有的几个小时就
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