实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问怎么确定上样量呢？怎么计算？为什么WB条带会跑歪，那怎么处理呢？

府宅

这要根据你做的蛋白表达量多少，一般是用DAB显色要50-100μg，用ecl曝光上样量为20-40μg。但根据你蛋白表达量的不同目标蛋白绝对量DAB法至少50pg，ecl法至少20pg。

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问RACE实验中，小胶跑的出来，胶回收却效果不理想怎么回事？

府宅

１）减少非特异性扩增。２）增加目的片段的产量。

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问同一个蛋白（带his-tag），分别用his和其特异性抗体去免疫，WB结果，his的正常，另外一个什么也没有（同一个人同时进行）

dxywode

WB或者anti-his的抗体检查His是否表达；从上游构建入手，改变His-tag的位置（C-terminal or N-terminal），必要时增加His个数（常用6-10个）

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问引物设计特异性好，但跑胶有隐约杂带是为什么呢

府宅

1.外源DNA污染，确保操作的洁净；2.Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度；3.若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。

4 回答753 围观

问骨组织wb内参不齐怎么整？

dxy_gwrp7ndq

不齐可以进行定量分析，然后用目的蛋白除以内参。定量用image plus6

4 回答887 围观

问wb怎么根据内参调整上样量

whilt-shirt

先用Image J计算内参的灰度值，然后选择其中一个样本作为参照，用这个参照样本的灰度值除以其他各组样本的灰度值再乘以各组上样量，就得到最终各自的上样量

3 回答14129 围观

问提高细胞支架材料的粘度性方式有哪些？

dxy_gwrp7ndq

最适合细胞粘附、增殖的材料表面应为中等湿润。运用等离子体表面改性技术，在高度疏水的P3/4HB 支架表面引入-OH、-COOH等基团，将材料表面的湿润度改善为中度亲水，为促进细胞的粘附创造了有利条件。

3 回答547 围观

问ChIP-seq和ChIP-ChIP相比有哪些优势？

府宅

ChIP-seq在样品数量方面比ChIP芯片更具优势，因为ChIP-seq需要更少的量。ChIP-seq产生更精确的蛋白质结合位点列表和转录因子，增强子和序列基序的鉴定。可以使用ChIP-seq分析染色质和组蛋白变体的核小体定位和翻译后修饰。这种分析尤其受益于增强的空间分辨率。

3 回答1164 围观

问请问wb和免疫组化用的抗体大多是通用的吗？说明书里要注意啥？

dxy_gwrp7ndq

一抗是否能够通用，还要看你购买的抗体说明书上是否标有IHC的字样。一般来说WB和IHC检测时候对一抗的要求是不同的，但是很多抗体也能通用，这是抗体生产厂家进行了检测。至于二抗，如果没有其他交叉反应，也是可以用于IHC的。

3 回答1488 围观

问免疫荧光实验蛋白荧光太强，甚至形成非特异性的标记。背景染色无法区分阳性区域，怎么办？

dxy_gwrp7ndq

如果背景太强，可以考虑换种封闭液或者增加封闭孵育的时间。可能是自体荧光，想知道组织是否有自体荧光，查看在非染色区域是否有荧光即可。有些自体荧光来自固定步骤，可以避免使用戊二醛固定，或者使用含0.1% 氢硼化钠的PBS洗涤以除去游离的醛基。还有些荧光来自内源性的荧光分子，可以用苏丹黑/硫酸铜进行光漂白。

3 回答596 围观

问内参蛋白有什么区别，如何选择合适的

府宅

1. 胞浆蛋白的内参与胞核蛋白的内参是不一样的；2. 在一定的实验条件下，内参蛋白的表达发生明显的变化时需要选择其他表达不变或者变化很小的蛋白；3. 当研究的蛋白的分子量与内参接近时，需要选择分子量与目的蛋白的分子量差距比较大的蛋白。

4 回答2168 围观

问原核表达中，IPTG诱导过程中，有必要摸诱导温度吗，一般最适多少度啊？

dxy_gwrp7ndq

建议室温和37度，做时间曲线(0,1,3,5,过夜)，IPTG用0.2mM，电泳检测

3 回答1342 围观

问蛋白印迹实验和流式细胞术都是使用抗体来检测细胞内靶标物质，两者如何选择

whilt-shirt

根据需要吧，但是最好两者都做，这样结果更可靠

3 回答396 围观

问蛋白提取研磨和破碎法选择

dxy_gwrp7ndq

研磨的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离，破碎细胞的程度比组织捣碎机高。超声处理的频率一般选在10KC至200KC，功率200-500瓦范围，处理时间有数分钟至数十分钟不等，处理过程中注意冷却。此法多用于微生物材料。

3 回答976 围观

问对含量少又不稳定的活性生物分子更为有效的分析方法是什么？

dxywode

吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。

4 回答444 围观

问rna的二级结构对全长rna反转录有何影响？怎样排除影响因素？

dxy_gwrp7ndq

AMV在高反应温度时可消除mRNA的二级结构对逆转录的阻碍

3 回答789 围观

问蛋白纯化常用的标签有哪些？

dxy_gwrp7ndq

常用的标签有His标签、GST标签、Strep II标签、MBP标签、Flag标签、 Myc标签、SUMO标签、组合式的双标签

6 回答2205 围观

问使用随机引物是否对样品质量要求更高？在提的时候有没有需要特别注意的？

dxywode

使用随机引物，即使使用的质粒DNA模板微量也能够进行反应，其在反应时对模板没有较为严格的要求。注意事项1.模板DNA应当为线性的。2.需要认真调整引物与模板的比例，如果引物比模板高，那么会得到较短片段的探针，然而累积较多的产物；相反，则反应产物比较长。

3 回答317 围观

问怎样减少值 RNA 酶污染的机会？

dxy_gwrp7ndq

必须确保与纯化的rna接触的每一样东西都是无rnase污染的。所有的表面，包括移液器、工作台、玻璃器皿和制胶设备，都必须用表面去污净化溶液如rnase喷雾清除剂处理过，去除各种溶液或者反应缓冲液中可能存在的rnase污染，可以用rnasafe。必须保证一直使用无rnase的枪头、试管和溶液，手套也应经常更换。

3 回答967 围观

问如何通过DNAstar测序已知序列

whilt-shirt

1、打开NCBI，搜索基因2、找到该序列的CDS序列，输入到序列的标准格式的文件中点击CDS序列，复制该序列即可，输入到标准的SEQ格式中3、打开DNASTAR软件，File-Enter Sequence，选择需要比对的序列，Done即可4、点击Align中的By clustal W method

2 回答678 围观

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