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        大分子WB的信号如何跑好?

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        sing生物狗

        研究的蛋白分子量约180KD,每次跑WB的信号都不太好,即使是过表达的情况下也很难获得比较好的信号,请问大家有好的方法改善吗?

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        5 个回答

        user-title

        whilt-shirt

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        用6%的胶,增加转膜时间和电流

        user-title

        邓豆豆逗

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        可以配置8%的分离胶跑,转膜可以考虑300mA恒流40min 做好降温,同时可以提高上样量和抗体浓度

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        ZQ新世界

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        首先配胶的时候不要浓度太高了,估计分离胶浓度要小于5%;其次,marker要用对;其三,电压小一些;其他的都是WB一般注意事项了,如①二抗不要孵太久;②TBST洗涤时可稍微延长点时间;③电转时放4℃或在里面放置冰盒;④孵抗体时记得用保鲜膜封住等等。

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        bamboopiggy

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        用低浓度的胶8%的胶,看marker将条带往胶的中间跑跑,一般就可以了。

        user-title

        未来9

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        选对凝胶很重要

        3种最常见的凝胶包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate. Tris-Glycine凝胶的PH为8.6,且保质期很短。在跑胶的过程中,PH还有上升的趋势,可达到9.5。这会导致蛋白降解和低分辨率。

        Bis-Tris凝胶的PH为6.4,相对Tris-Glycine凝胶,稳定性和保质期都有所增加。但这种凝胶需要在溶液中增加抗氧化剂,比如DTT,以维持蛋白的还原性。

        Tris-Acetate 凝胶的PH为7,跑大分子蛋白会呈现很高的分辨率。跑大分子蛋白时,我们推荐使用Tris-Acetate 凝胶。

        凝胶浓度很重要

        既然选择了Tris-Acetate 凝胶,还有几个要考虑的问题。凝胶浓度与孔径成反比:浓度越小,孔越大。较大的蛋白质更容易通过较大的孔,所以我建议使用低百分比的凝胶,如7%。可以使用梯度凝胶或非梯度凝胶,梯度凝胶非常适合新样本。

        提高转移buffer中的SDS,减少甲醇

        转移buffer的组成至关重要。如果有甲醇存在,大分子蛋白很容易沉淀。通过减少转移buffer中的甲醇百分比(10%或更低)来避免这种情况发生。为了进一步确保蛋白质不会沉淀,考虑添加SDS至终浓度为0.1%。SDS向蛋白添加均匀的负电荷,使得它们更容易从凝胶转移到膜上。

        选择合适的膜

        膜一般有PVDF膜或NC膜。跑大分子蛋白选择PVDF膜。大多数蛋白质(> 20kDa)可以用0.45um膜转移,避免使用0.2um孔径。

        增加转印时间

        在正确的选择完凝胶、转印膜及转移buffer后,转印正式开始。半干转快且方便,但不适用于大分子蛋白。建议湿转,因为大分子蛋白转移时间很慢,推荐350-400 mA转移90min或 4°C,40 mA,转印过夜。

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