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问
WB条带大小和预期差别大,变性后的样品大蛋白降解快怎么办呢?
天一湖医者
确定蛋白是内源的还是外源的,如果是外源蛋白是不是全长序列SWISSPROT 数据库查询该蛋白是否有其他 isoform; SWISSPROT 和文献查询蛋白质是否有剪切活化,剪切活化造成蛋白变小; 确定蛋白质是否是二聚体或多聚体。 NCBI 和 SWISSPROT 查询蛋白质表达后是否有修饰,如有修饰会导致蛋白质增大;
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问
做WB中裂解液与细胞的比例?
bamboopiggy
6孔板长满,大概用100-200ul收,就可以测浓度。组织的话,一般是1mg:100ul就可以。脑组织的话1:50更好
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问
玉米种子胚乳和果皮怎么样能更快速的分开,以降低RNA的降解?
迟C迟
是需要提取胚乳的RNA吗?我们一般取未成熟样品,在冰上用镊子挤出胚乳迅速放入液氮,提RNA问题不大。
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问
小分子蛋白的WB要怎样跑?
天一湖医者
跑胶时注意观察溴芬兰前沿,小分子不要跑太久,前沿接近胶底部就可以了。另外跑完胶染一下胶,看看你marker的11kd那条带在什么位置
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1783 围观
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问
请问是所有的DNA染料都需要避光4度保存吗?
迟C迟
尽量避光保存。现在商业化的DNA染料还是比较稳定的,不必过分担心。
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问
请问DNAmarker长时间放在室温下,会导致跑不出来条带或条带弥散不清晰吗
迟C迟
一般不会,我们实验室都是常温放置的。如果出现条带弥散的情况,可能考虑是不是电泳缓冲液需要重新配置了。
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问
为什么有的时候跑不出条带,然后背景还很糊?
迟C迟
背景模糊可能有以下几个原因:1. 没有封闭好,可能很大2. 一抗浓度太高,适当降低增加一抗稀释比例,你最好先做个titration,确定一个最佳的抗体稀释比例3. 二抗孵育时间太长,一般室温45min,二抗切不可孵育时间太长没有目的条带是主要问题,检查样品蛋白和抗体。
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问
目前国内蛋白质阵列技术有什么发展前景
迟C迟
蛋白质微阵列亦被称为蛋白质芯片,可以实现对生物蛋白分子准确、快速、大信息量的检测, 是一种高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术. 简单地说, 就是一次试验中同时检测几百甚至几千种目标蛋白/多肽的分析技术。
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682 围观
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问
菌体破碎后用包涵体溶解液溶解后需要用0.45nm 的滤器过滤,但是总是堵住滤器,没有办法过滤,咋办呢?
迟C迟
可以用超声再次破碎一下菌体,裂解更充分。再者可以先离心裂解液,再用过滤器过滤。
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问
在显色设备支持的情况下,荧光显色和化学发光显色,如何选择?
迟C迟
关注这么几点就好了,灵敏度要高,稳定性要好,背景要低,成本最好越低越好,几种方法各有优缺点。现在化学发光显色试剂盒ECL灵敏度最高的能够达到飞克级别了,不仅灵敏度要高,检测范围也要广,我们前段时间试了炎熙的极敏型试剂盒,灵敏度很高,也有其他灵敏度的可以选择,例如增强型,超敏型,稳定性都很好。
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613 围观
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问
Co-IP下游还可以开展哪些分析实验?
迟C迟
根据你的实验目的来,多看看文献,看看相同领域的研究者是怎么做的。CO-IP一般是验证性的,下一步可以通过基因编辑在实验对象上验证蛋白功能。
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587 围观
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问
影响盐析的因素具体有哪些?
迟C迟
影响盐析的因素很多,如蛋白质的浓度,盐的浓度,饱和度和pH,温度等都可影响盐析的结果,操作时要充分注意。 盐析时,溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响,既可影响蛋白质沉淀极限,又可影响蛋白质的共沉作用。
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问
Rna提取提纯实验中,用来溶解RNA的DEPC水 是否要经过高压处理
迟C迟
商业化的DEPC水不需要再处理。注意分装使用,以防污染。
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724 围观
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问
Co-IP实验如何避免出现假阳性?
未来9
Co-IP选择抗体尤为关键,特异性抗体可以排除非特异性结合进而排除假阳性。同时可以结合Co-IP反向验证进一步排除假阳性。若抗体浓度过高,则降低抗体浓度;若抗体特异性不好,则更换抗体。
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598 围观
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问
蛋白质微阵列技术的影响因素有哪些?
迟C迟
蛋白质微阵列就是蛋白芯片技术,固定在芯片上的蛋白可以是:抗原、抗体、小肽、受体和配体、蛋白质-DNA和蛋白质-RNA复合物等。所以影响因素包括样品质量、检测技术和数据分析。
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问
谷类蛋白质凝胶在实际生活中有那些应用?
未来9
对各种水进行过滤、分离,从而对水质进行纯化处理。
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1086 围观
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问
染色质为什么要片段化?片段化的长度为什么是200-1000?片段化过度或不足对实验会有什么影响?
bamboopiggy
你说的是做chip吧?chip是要把染色质打断,好让你的目的蛋白和dna更好的结合,太长了构象复杂,不利于蛋白质和dna的结合,一般打的片段,在200-1000bp之间,就可以。太小了,可能结合不好。
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1028 围观
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问
常用的蛋白纯化标签有什么特点?如何选择?
未来9
蛋白标签大体可分为三大类:遗传标签、in vivo标签和in vitro标签,最为常用的是遗传标签,即c-Myc、FLAG等。通过将目的基因克隆到含有标签的载体上,方便在下游通过抗体、荧光检测蛋白,或对蛋白进行纯化如何选择:1. 首先需要确定融合标签的目的,蛋白纯化首选His-Tag,Western blot首选Flag-Tag,免疫共沉淀可选择Flag-Tag或其他常用标签如HA、cMyc,活细
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1975 围观
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问
请问果汁有机酸含量测定这个实验怎么做?
迟C迟
请参考GB 5009.157-2016,食品中有机酸含量测定有详细步骤。
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891 围观
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问
SSR分子标记如何定位基因
迟C迟
简单重复序(SSR)也称微卫星DNA,其串联重复的核心序列为1一6 bp,其中最常见是双核苷酸重复,即(CA) n和(TG) n。主要通过微卫星序列两端互补序列设计引物,通过PCR反应扩增微卫星片段,由于核心序列串联重复数目不同,因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物,将扩增产物进行凝胶电泳,根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。在真核生物中,存在许多2-5bp简单重复序列,称
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