实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问凝胶柱层析关键的一环，如何选择凝胶填料？

dxywode

使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广阔的介质如Superose、Sephacryl HR依据分子量将样品分成不同组份。用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样品。体积大的样品，往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的

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问蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，影响盐析沉淀的因素有哪些？

小布丁瑶瑶

蛋白质水化膜；蛋白质带电荷性可以影响

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问蛋白质分离纯化，用什么方法最好？

丁香粉猪猪

一、常用的破碎组织细胞的方法有：　　1.机械破碎法　　这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。　　2.渗透破碎法　　这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。　　3.反复冻融法　　生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。　　4.超声波法　　使用超声波震荡器使细胞膜上

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问如何确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的并避免污染的发生？

张张321

使用单克隆抗体有助于避免污染发生

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问蛋白质不表达，蛋白表达量低的原因？

迟C迟

蛋白不表达就说明他的转录和翻译，这个过程出现了问题。表达量低说明他这个合成蛋白质的效率是很低的，可能在盘旋折叠最后一个部分出现了问题。

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问如何从鸡蛋清中提取卵类黏蛋白？

府宅

取新鲜蛋清，搅拌，加入等体积10% pH1.15的TCA溶液，继续搅拌直至絮状消失，调pH到pH3.5±0.2的范围以内。pH值调好后，将烧杯用保鲜膜密封好, 室温下静置4小时。 4000r/min 离心15min，弃沉淀，上清液用滤纸过滤，收集滤液。调pH到pH3.5±0.2的范围以内，边轻轻搅动边加入加3倍体积的预冷丙酮，用塑料薄膜封好杯口，在4℃下放置4h以上。3000r/min离心15mi

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问免疫组化和 Western Blot 可以用同一种抗体吗？

whilt-shirt

大部分可以，有些不可以，具体要看抗体的说明书

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问TaqMan 探针荧光定量 PCR 的原理是什么？

dxywode

在Taqman探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针的5’端标记有报告基团（Reporter，R），如FAM、VIC等，3’端标记有荧光淬灭基团（Quencher，Q），如TAMRA等。当探针完整时，报告基团所发射的荧光被淬灭基团吸收，仪器不能检测信号。随着PCR反应的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3’→5’外切核酸酶活性被探针切断，报告基团远离淬灭

3 回答2122 围观

问蛋白质免疫印迹试验结果膜上没有目标条带是怎么回事？

whilt-shirt

考虑转膜没转上或者一抗二抗失活

3 回答481 围观

问如何检测不同批次的RNA之间的差异，有什么好方法能避免批次差异呢？

迟C迟

不同批次提出来的RNA有差异是在所难免的，只要提取质量高、浓度达到要求，一般不影响接下来的实验。

3 回答476 围观

问第一次做CO-IP实验，有什么注意事项？请做过的大佬们提提经验避避雷

lyang556

首先明确实验目的，确定抗体和需要捕获蛋白。然后注意研究实验步骤，可以参阅别人的实验经验，少走弯路。选择合适的试剂，操作时要认真，尤其是样本制备和Pre-clearing过程。

3 回答283 围观

问wb实验怎么选择抗体，设计实验能省一点钱呢？

bamboopiggy

1.做预实验。2.尽可能的把蛋白条带的size错开。如果就几条带，可以把胶切小了，减少膜的用量。尽量切膜，加抗体，不要加全膜，除非实验必须。3.找公司申请抗体的试用装，或者找别的实验借。

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问湿转转膜时间与蛋白大小有没有必然联系呢？

迟C迟

有关系的，转膜时间太长，小蛋白会从膜中穿过。

3 回答3071 围观

问为什么显影时，marker比条带还要显？

迟C迟

本来商业化的marker就更容易跑出明显的条带。目标条带淡说明目的蛋白少，可以调整上样量，marker少加点，目的蛋白多加点。

3 回答722 围观

问wb内参不齐怎么调上样量

迟C迟

我们一般认为每个样品表达的管家基因（House Keeping）的量应该是一致的，用做内参检测应该是恒定不变的。其实不是，所以这里提示大家，如果检测某一个内参差异很大时，我们可以更换另一个内参检测！

3 回答10252 围观

问chip-seq一般多少细胞满足要求？一般生物重复能做么？

迟C迟

可根据自己的实验设计，在开始实验前计算所需要的 ChIP 反应次数，准备相应足量的组织或细胞。因此，我们建议以⼀个样品组为标准，准备约 100 到 150 mg 组织样品(每个样品组能满⾜同时进⾏目的蛋白抗体、阴性对照 IgG、阳性对照 H3 抗体等多个 ChIP 反应的用量) 。

3 回答1543 围观

问样品体积增加后，对蛋白质的纯化效率有怎样的影响？

迟C迟

样品体积增加，是提取的样品量增加了吗？建议裂解液同步增加，裂解时间也需要延长，不然会影响蛋白纯化效率。

3 回答666 围观

问组织小浓度低时RNA提取纯度问题

迟C迟

肯定影响后续实验的，可以多提几次，富集一下RNA，同时保证纯度，才能保证后续实验质量，不然做了也是白做。

2 回答277 围观

问等电聚焦电泳实验中发现背景过高，可采取的策略是？

迟C迟

控制以下几项：槽液的PH、电导率、固体份、颜基比、温度，电泳时电压。检查试剂是否正确、是否过期，最好重新配电泳液、缓冲液这些。

3 回答776 围观

问用tamoxifen灌胃诱导creert2小鼠，但是不小心灌了一点点到肺里了，小鼠有点呛到，但是没有死…这样能诱导成功吗？谢谢

小布丁瑶瑶

阿莫西林是治疗细菌性肺炎，你灌胃失误是异物性肺炎，很难救治，建议换一只小鼠

3 回答628 围观

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