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问
跑WB时,各通道上样蛋白是浓度相同还是质量相同?
府宅
将蛋白浓度高的样品稀释到最低浓度的样品,这样他们的浓度就相同了,上等样体积的量就含相等的总蛋白,等体积上样
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问
ANP小分子蛋白20kD以下什么条件可以更好的曝出条带,经常出现白膜
府宅
很多常规的膜孔径为0.45um。你如果做小分子,17kd以下都跑掉了,那你应该试试0.2um孔径的膜。有一个小诀窍是转膜时叠两张膜一起转,如果小分子蛋白跑过了前面一张膜,那总还有可能被后面一张膜抓到。
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问
有关WB实验转膜失败的问题?
天一湖医者
你的电转条件是湿转还是半干,如果是湿转,试试变换一下转膜条件,注意一下电转液中甲醇的量,因为它是用来洗脱蛋白上结合的SDS的,而SDS多了很可能就转不上膜.一般甲醇量在15%左右.另外PVDF膜要用甲醇浸透,并且平衡时间一定要够.
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问
为什么同一张膜电泳后裁开敷不同的抗体,曝光后的条带有的背景很高,有的背景很干净?
府宅
可能是你敷抗体的时候敷的不均匀。
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问
凯式定氮法与双缩脲法测定时的异同。
dxy_gwrp7ndq
双缩脲法有重复性、线性关系好的优点,有灵敏度低、测定范围窄、样品需要量大等不足。凯氏定氮法进行蛋白质检测的,测定范围在0.1mgN~200mgN(毫克氮)(含氮量0.02% ~ 95%),需要的样品量也不像双缩脲法的那么大,只需要几克就行,因此,能够满足样品量不那么丰富的物质测定。
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问
干燥RNA的时候是要干燥到什么程度最好?需要保持湿润吗?
迟C迟
最后的到RNA的上一步是酒精洗涤,提取的RNA当然不是完全干燥,提取后可以用小号枪头洗出较多的液体,剩下就在空气中自然干燥;但是太干就不容易溶解,因为太干的话RNA之间就结合的非常紧密。
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问
加入乙醇洗涤能吹散沉淀吗?是吹散让它更纯还是会影响下一步操作?
天一湖医者
将一定量的乙醇加入之后,能够通过离心回收所有形成的核酸沉淀,并不能吹散沉淀。
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问
提酵母菌和提细菌的RNA有什么区别吗?分别有什么注意事项?
bamboopiggy
酵母菌因为rna含量较多,dna含量少,所以一般用稀减法提取,细菌的一般和细胞一样,用酚氯仿抽提就可以了。
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问
枪头必须使用无酶的枪头,若只有普通枪头怎么处理呢?
迟C迟
要用DEPC水泡2天,再报上报纸,高压灭菌,就可以用作RNA实验了。
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问
一个基因有3个转录本,应该选取哪个反转录呢?
天一湖医者
1、带有MANE Select transcript标签,说明在ensemble和NCBI数据库中均认定该转录组是最主要,最保守和最高表达的。选择该转录本即可2、如无MANE标签,可看 APPRIS,它是相似的评价标准,P1代表最主要最相关的转录本。3、如无以上标签,可看注释,CCDS显示转录本的编码序列,与ensemble和NCBI数据库相匹配。
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问
WB结果中,目的条带后面为什么有细细的条带?
未来9
可能是样品溶解不好,或存在一定程度的蛋白降解
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问
检测RNA病毒,使用一步法还是两步法?
天一湖医者
一步法优点: 只需一步,反应发生在单管中,速度比两步法更快,而且需要较少的准备和操作时间。处理大量样品时易于操作,减少污染的机会。整个cDNA样品都被扩增,灵敏度更高。缺点: 同一样本只有有限数量的目的基因被扩增。另一个挑战是组分的兼容性,因为一步法需要转录和扩增之间的平衡。 两步法 优点: 可以分析同一样本的多个目标。逆转录步骤将样本中所有的RNA转换为cDNA,可以储存cDNA用于后续实验,检
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问
染色后可以用自动细胞计数器计数吗?
whilt-shirt
可以,染色只是区分活细胞和死细胞,不影响计数
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问
请问修饰后能用什么纯化方法可以把修饰的和未经修饰的分开?(当然修饰后还残留有聚乙二醇,这个小分子也要除掉)
崔果儿
大多用凝胶过滤,这也不错的做法,毕竟PEG是链状的分子,在柱子上和普通蛋白行为不一样,修饰度越高那么出峰也越后,因此蛋白选择sephadex G50试试,它的范围在1000-30000,应该是不错的选择。此外PEG是个疏水性的链,修饰后的蛋白疏水性增强,修饰度越高,疏水性越强,可以用这个原理分离。离子交换也可以选择,因为同样道理,修饰度越高,电荷被屏蔽也越多,电荷也越少,因此应该修饰度越高越先出。
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问
超滤技术的关键是膜,膜都有哪些分类,各自的特点适合的实验是哪些?
天一湖医者
超滤膜的分类有很多:按照膜组件的不同分类:有管式超滤膜,板框式超滤膜,卷式超滤膜和中空纤维式超滤膜。按照按照压力驱动形式的不同:可以分为外压式和外压式。膜材料的不同分类:有有机超滤膜和无机超滤膜两种。
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问
western做p-AMPK和AMPK时,是先把一种抗体洗脱了再敷另一个,还是可以平行着分别做?
dxy_gwrp7ndq
如一抗种属来源不一致,即使分子量接近的蛋白,只要洗脱够彻底,也不会产生多条带,就可以一起做。
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问
western blot,最后显影不特异,怎么办。
vae1476
没有特异条带吗?那考虑样本没问题的话,最可能出问题的是一抗,一抗的特异性决定了结果的特异性
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问
请问在做bifc时,如何确定荧光发出的原因,是因为两个蛋白间相互作用,而不是因为两个蛋白浓度过高物理靠近发出的,如何界定这个浓度
天一湖医者
本实验需要设置阴性对照。即用pIB-YN155和pIB-nVC156 (VC156的N端带有atg,可以单独表VC156蛋白)。利用荧光显微镜观察时,需要调节荧光强度,在阴性对照组无荧光信号的情况下,观察实验组的荧光信号。
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问
ChIP实验中需要选择ChIP级别抗体,没有ChIP级别抗体该怎么选择?如果我的实验种属比较特殊(果蝇,昆虫,植物等)该怎么选择
vae1476
实在没有的话,可以联系公司订制,但时间比较长,急的话,可以拿IP/IHC/ICC级别的抗体进行尝试
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问
请问牛乳酸度的测定这个实验怎么做?
府宅
实验步骤:1.配制0.1mol/L的NaOH标准溶液:用小烧杯在粗天平上称取固体氢氧化钠0.80克,加水100毫升,氢氧化钠全部溶解,将溶液倒入200ml的容量瓶中,用蒸馏水定容,充分摇匀。2.标定0.1mol/L的NaOH标准溶液:用减量法称取0.3-0.4克邻苯二甲酸氢钾,(精确到0.0001克)于250毫升锥形瓶中,称两份,加入100毫升水溶液,加三滴酚酞指示剂,用以上配好的氢氧化钠标准溶液
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