对蛋白质分离纯化时，如何能够取得纯度高和总回收率高的

1、 明确目标

对于纯化样品，应该要明确最终产品需要达到的纯度、活性和产量的要求，要避免过度纯化或者因为纯化步骤或者分辨率不够而达不到想要的纯度。

2、 明确目标样品的特性和关键杂质

根据样本和杂质的特性选择适合的纯化方法，纯化技术的选择要简单化，并且要产生最佳的纯化效果。

3、 明确检测分析技术

能快速和准确的检测样品活性，纯度和回收率。

4、 合理安排纯化步骤

尽可能少用添加剂和尽可能早的去除对样品有损伤的杂质，并且要减少额外的纯化步骤。

组织必须进行研磨、匀浆、超声处理(注意降温)，蛋白质溶解度会更好，离心要充分(12000转/min，10-15min)。膜蛋白必须用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性(加入足量的PSMF)。

1、操作尽可能置于冰上进行。

2、不要太稀，蛋白浓度在μg/ml以上

3、合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的缓冲溶液pH避免与pI相同，防止蛋白质的沉淀。

4、使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解DNA，防止DNA对蛋白的污染。

5、避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性。

6、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。

7、在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/LDTT（二硫苏糖醇）(或β-巯基乙醇），防止蛋白质的氧化。

8、加1~10mmol/LEDTA金属螯合剂，防止重金属对目标蛋白的破坏。

9、使用灭菌溶液，防止微生物生长。

诱导时间最好提前做一下预实验，可以先试试25或者30℃附近，这样可以提高纯度和回收率

买预裝柱，别自己填柱子。尽量提高菌或细胞蛋白的产量。但是上柱浓度别太高，流速慢一点。注意低温。

试试同样截留分子量的Hydrosart和RC膜材质的超滤管