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问
WB时为什么跑出来的条带总是斜的
迟C迟
主要可能是电泳凝胶配制时未搅拌均匀,造成条带未能直线跑完,电泳凝胶中混入气泡,造成条带被挤压倾斜,也可能是样品和缓冲液有干扰,造成条带迁移率不统一,另外上样量过大,被其他泳道挤压也有可能。
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问
蛋白裂解到底多长时间就可以呢?
迟C迟
加RIPA裂解液,4℃摇床上裂解26h和14h即可。
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问
怎样确定最佳缓冲条件和浓度使非特异性结合到羧酸酯化葡聚糖上的靶蛋白和配体蛋白最小化。
dxy_gwrp7ndq
可以进行预实验确定最佳缓冲条件和浓度使非特异性结合到羧酸酯化葡聚糖上的靶蛋白和配体蛋白最小化。
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问
18%分离胶跑酶解蛋白,60mg/ml 上样量10ul,80V浓缩胶120v分离胶跑出条带呈Y型且拖尾严重,求解
dxy_gwrp7ndq
如果蛋白含二硫键的话,还原剂量不足,可能会导致蛋白在跑胶过程中的动态成键,也可能形成拖尾。"拖尾"现象是电泳中最常见的现象。这常常是由于样品溶解不佳引起的,克服的办法是在加样前离心,选用合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液,加增溶辅助试剂。另一方法是降低凝胶浓度。
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问
请问PI3K-AKT信号通路里的PDK1用WB检测的时候一般测总量,还是测其磷酸化啊?!
府宅
PI3K-AKT通路一般测AKT/PKB信号通路磷酸化蛋白,可以通过检测抗体芯片(PAB216)
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问
制胶的时候上层浓缩胶制少了,下层多了,但是梳子插得进去,在跑的时候怎么设置参数?
bamboopiggy
可以适当降低电压,由原来的80吧,改为40-60v,跑的慢一些。让蛋白在浓缩胶和分离胶之间能压成一条线就可以。
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问
保存的蛋白质复性,一般使用多少度水浴?到什么程度是复性成功呢?
未来9
样品放入零下20度冰箱中储存,需用时在取出后使用前在110度沸水中加热3分钟室温冷却后再上样,以去掉样品蛋白质中的亚稳态聚合体。
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问
染色的标本的核周围有杂质?是什么地方有问题?
bamboopiggy
大概率是你的抗体坏了,看看需不需要重新配抗体,或者洗片子的时候,多洗一次。
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问
最终染色不均匀是孵育温度有变化吗?还是别的问题?
bamboopiggy
是你抗体加的不均匀,温度也会有影响,但是抗体的原因比较大。
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问
0.3%H2O2-80%甲醇室温孵育这一步,是将两个试剂混合加入后孵育吗?
bamboopiggy
是,用甲醇配置H2O2,到0.3%,加入孵育。
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问
从胚胎中提取RNA时,应注意哪些原则?
迟C迟
1. Trizol试剂含有苯酚,具有毒性和刺激性,注重操作。2. RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉,注重配带手套,样品尽可能盖严。3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率,因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质(结缔组织和骨除外)。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作,防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。
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问
荧光素酶互补实验验证蛋白互作的载体图谱以及酶切位点
bamboopiggy
仅供参考,不知道你手里质粒的名称,只能猜测是这个俩个吧
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问
SDS凝胶电泳的上样量大家一般用的多少啊?
未来9
一般上样体积为10-15μL(即2-10μg蛋白质)
4 回答
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问
WB实验中条带没有间隔的原因?
bamboopiggy
感觉是你上样浓度太大了,试试降低浓度。还可以降低抗体的浓度。没有间隔。主要是因为发光太强了。
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问
同一胶连续三个孔做重复不一样
我也是锦鲤ye
湿度、温度,实验过程操作的人工误差
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问
为什么跑胶时 那个样品条带跑的很宽?有人说是胶不好也有说电泳液时间长了,不知道原因?
未来9
有三种可能的原因。1.电泳缓冲液用的次数过多,一般来说电泳缓冲液用过两次以后电泳的效果就会变差。2.电泳的浓缩胶和分离胶缓冲液的PH没有调好或浓度没有调好。浓缩胶和分离胶胶浓度的变化和PH的变化让电泳样品压缩在一起。一般情况下浓缩胶缓冲液(Tris—HCl,pH6.8)、分离胶缓冲液(Tri s—HCl, pH8.8)。3.提取的粗蛋白样品里面有杂质,细胞里面除了含有蛋白质还有核酸、多糖、纤维素等
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问
怎么通过氨基酸序列推测它在折叠后的空间结构域
bamboopiggy
网上有好多预测工具,你可以试试,尤其最近AI出现,更方便了。如alphafold2
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问
293T细胞外转泛素老是表达不齐怎么办?
府宅
防止细胞污染 细胞污染也是造成细胞死亡,转染效率低下的一大原因
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387 围观
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问
请问SDS-PAGE蛋白质样品上样后在高压下快速跑完和低压下慢速跑区别大吗?哪个更好?
dxy_vx1y73j9
低压条件下,条带相对均匀,位置更准确;高压条件下,由于加样量与样品浓度的差异,有可能导致条带不是一字型,或者跑斜;具体以自己样品与实验为准,多实验对比,如果高压和低压一样,那肯定高压,省时间。
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504 围观
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问
细胞生物标记物检测的方法:WB法和流式细胞仪,单用一个就行?还是必须联合使用
listener0014
另外一个也看经费是否充足,如果不差钱,肯定是越全越好
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