同一胶连续三个孔做重复不一样

湿度、温度，实验过程操作的人工误差

有条带吗？上样量一样吗？蛋白样品是不是上样之前未混匀？是不是膜被手反复摸过，导致重复的空条带不一样。

如果两个平行孔的OD值相差太大的话，有可能你酶标板没有包被好！其实也跟实验过程人工误差有关的，尽量减少操作所产生的误差。每次加完样品要适当的震荡一下，保证抗原与抗体反应充分。

1.可能是你上样，虽然三个重复，但是还是有不准。2.转膜的接触不好。3.抗体加的不匀，没有完全浸泡条带。

借佛献花，来源于：知乎中的一篇文章：《Western Blot（WB）操作中需要注意事项 与结果不理想可能的原因自查》，黄明威。有杂带或背景的原因

1）目的蛋白有多个修饰位点，本身可以呈现多条带，建议查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小

2) 样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作

3）二聚体或多聚体存在，建议增加蛋白质变性过程及强度

4）上样量过高：降低上样量，减少抗原含量

5）二抗条件过强：降低二抗浓度、缩短二抗孵育时间或改变温度等

6）一抗条件过强：降低一抗浓度、缩短一抗孵育时间和改变温度等

7）抗体质量不佳：如特异性不好，建议购买品牌公司的抗体

8）一抗稀释度不适宜，可以对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度

9）一抗孵育的温度偏高，建议4℃结合过夜

10）抗体浓度过高或洗涤不够，建议降低抗体浓度，增加洗涤次数和时间

11）膜清洗不全：增加清洗强度，如增加荡洗次数、延长清洗时间或加0.05-0.1%Tween 20等

11）ECL发光液本身因外源污染等原因存在很强的背景光，显影可以显示强的背景光，建议分装A和B液和更换发光液

12）缩短压片或曝光时间

13）膜没有完全均匀湿透，建议使用100% methanol浸透膜

14）电极不平衡或者加样位置偏斜，可以调整电极和加样

15）封闭不全：二抗与抗原有交叉反应，升高封闭剂浓度、延长封闭时间或更换不同的封闭剂，孵育时保证封闭液完全浸没转印膜

16）封闭物使用不当，比如检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭；

17）封闭时间不够，一般情况下室温37度封闭1小时以上或者4度封闭过夜

18）抗体非特异性结合，可以降低抗体浓度，减少孵育时间

19）化学显色底物过多，建议按说明书加入适量的显色底物

可能和转膜有关，应该是转膜时候受力不均，可以考虑换夹子，或者加滤纸