实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问用比色皿还是微孔法好呢？总体算下来，哪个更节约经费啊？

bamboopiggy

微孔法啊，上样量少，省时间。还不用洗皿。

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问配置的蛋白标准液是现配好，还是提前配好−80度冻上？

迟C迟

那得看用什么检测了双缩脲法需要现配置水合茚三酮可以使用提前配置好的溶液

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问间接法和双抗体夹心法有什么优劣吗？建议使用哪个？

天一湖医者

双抗夹心法：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化，孵育2次，操作简单，减少人为因素的影响，可靠的特异性。间接法：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。缺点：双抗夹心法：缺少链霉亲和素的抗体，起不到型号放大作用，而且抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。间接法：要经过三次孵育，操作步骤繁琐，稍微不注意

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问wb显色出来背景黑，条带不明显，而且跑出来带歪歪斜斜，这是咋回事呀？

迟C迟

1.牛奶或封闭用BSA产生的非特异性结合，引起背景。这在使用种属来源于山羊（goat）的一抗时常有发生，因为山羊来源的蛋白与牛来源的蛋白具有较高的同源性，抗山羊二抗容易与牛奶/BSA特异性结合产生背景；此种情况下，一般推荐用驴血清封闭；笔者经验是如无驴血清，仍可用牛奶封闭，只不过笔者会提前一天用牛奶配制二抗，提前让二抗与牛奶进行非特异结合，并回收二抗、重复使用，笔者的这种方法做出来的条带背景与朋友

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问western条带杂出来模模糊糊是为什么？

bamboopiggy

你内参不这么模糊吧？你提高一下一抗浓度x,改为1:1000，就好。蛋白上样量太高，你的内参就不好了。

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问在Western blot中，经常回收一抗反复使用，但常常遇到即使回收一次的抗体也会发生沉淀，影响最终实验结果，请问如何解决？

bamboopiggy

如果发生沉淀，就不要用了，尤其是非内参抗体。直接新配可能更好。

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问小白提问，为什么跑western blot条白出来是空白的呢？内参也是白的，苦恼死了

天一湖医者

目的蛋白没转到膜上，或者你根本没分离出来探针有问题

4 回答689 围观

问wb的一抗该怎么选择，二抗是多个蛋白样品共用的吗

whilt-shirt

一抗一般选择兔来源的抗体，兔来源的抗体要稳定一些，二抗是根据一抗来定的，而且比较便宜，一般抗兔、抗小鼠都会备一点

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问WB实验怎么避免两个泳道的样品在显色的时候条带连在一起？

天一湖医者

1.上样量过大 ,一般上样在20-100ug之间就可以，上样的体积尽量小一点，10—20ul为宜。上样一定要迅速，点完后需立刻开始电泳，否则会引起样品扩散。样品中盐浓度高也可以引起。样品要充分混匀，煮沸变性。 2.一抗孵育时间过长，适当缩短孵育时间，通常4度过夜为宜。 3.一抗和二抗浓度过大，抗体如果很好用的话，增大稀释比例试试。 4.曝光时间过长，同样会由此现象。不同的时间多曝光几次。

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问重组人rac1蛋白检测生物活性方法

丁香粉猪猪

仅供参考可以看看这个，学习一下

1 回答420 围观

问求大佬给点思路/::<

迟C迟

把酶量减少，酶切时间减少，再检查一下你的载体序列，是不是还有这两个酶识别的位置。

3 回答515 围观

问EMSA实验，为什么结合的shift有两条带

天一湖医者

结合的shift有两条带，有可能试剂出现问题！

1 回答728 围观

问在蛋白质纯化时，用PH2.0的酸性buffer洗脱，为什么不担心蛋白会遇酸沉淀？

豪杰6MBA

ph=pl ，打到蛋白质等电点蛋白会产生沉淀，ph2.0应该是过了蛋白的等电点,所以不会产生沉淀。

4 回答854 围观

问TaqMan荧光PCR检测技术和实时荧光定量PCR技术的区别？

bamboopiggy

taq探针法，除了要设计普通的实时荧光pcr的引物之外,还要设计一条与探针结合的引物。taq探针法精度更高一些，但是普通实验的话，用实时荧光法就好，更方便一些。

3 回答563 围观

问C反应蛋白的检测方法为什么有3分钟也有10分钟出结果的，不同点在哪里？

bamboopiggy

这个取决于你用的kit的条件,有的灵敏，可以时间短，温度低，有的不灵敏，就需要时间长一些。有些可能还需要37度孵育。

2 回答1494 围观

问WB条带模糊，有很大的阴影盖住条带，什么原因？

迟C迟

是出现非均一性背景吗？可能是你的膜曾经干过，在每一步操作过程中，都需要注意不让膜干。

4 回答627 围观

问如何提高筛选出标记蛋白

小刘小刘世界一流FVJ4

这个问题信息量太少了，你如果已经标记好了，还是荧光标记，那就去看荧光，如果想得到这个纯化蛋白，那就去层析，

3 回答317 围观

问植物总蛋白提取相关，请问怎么提取植物总蛋白效率高，如何能western时不反白

bamboopiggy

你wb反白，就是因为你蛋白浓度高了，最好降低上样浓度试试。因为蛋白浓度高，辣根过氧化物酶反应剧烈，在你来不及显影之前，就把发光底物消耗光了，反而不能发光了。

3 回答707 围观

问做wb的时候，经常做出来结果漂移，越来越高，是怎么回事？

丁香粉猪猪

当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走。使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。另外，转膜时转膜液要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。

3 回答874 围观

问RT过程以相同效率反转录rna，是什么意思？怎么实际操作呢？

天一湖医者

RT过程应以相同效率反转录RNA，否则会影响qPCR的启动效率，进而带来不同的实验结果，因此对于每个RT反应应使用相同的条件。如果你需要对同一样本的多个目标进行分析时，可选择两步RT-PCR。另外，当RNA的存储是个问题时,最好是进行两步RT-PCR，因为cDNA在-20℃是稳定的。

4 回答546 围观

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