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问
WB杂带多怎么回事,做了好多次都是
迟C迟
.1.原因:细胞系传代次数过多,蛋白表达谱发生变化。建议:使用未传代或传代次数较少的细胞系(不超过15代)进行样品制备。 . 2 .原因:与细胞系裂解物相比,原代细胞或组织提取物会倾向于有较高的背景和降解条带。建议:1. 用新鲜提取的,经过超声处理的澄清的组织提取物能降低背景。2. 同时,用去垢剂含量较高的RIPA buffer裂解组织,可得到裂解更彻底、一致性更高的裂解物。 . 3 .原因:蛋白
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问
找不到蛋白抗体,可以用其他物种的同蛋白的多抗么?有没有什么办法可以检测出暂时没有抗体的特定物种蛋白的表达情况?
bamboopiggy
看你蛋白的保守性如何,如果保守性好,可以试试别的物种的抗体。对于没有特定抗体的蛋白,可以试试从rna水平先检测一下表达,跑个realtime pcr
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问
如何去除RNA提取过程中的蛋白质污染
dxy_gwrp7ndq
提组织的RNA有的时候蛋白的含量会很多,可以在加TRizol和氯仿抽提完第一次以后不加异丙醇,而直接加入TRizol氯仿再抽提一次,第二次抽提后会发现中间的蛋白明显减少的,如果感觉蛋白还是很多的话,再抽提一次也是可以的。
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问
WB内参总是不齐怎么办?
Lv花开花落
1.定量是否准。不知道题主实验室是用什么方法来进行蛋白定量。我们组是用蛋白标准品和标准曲线的方法进行定量。这种定量的方法要注意用的移液枪准不准(一个量程的话,每次加的都不准的现象要避免);样品的浓度要在标准品画成的标准曲线中部;标准曲线的R方要大于0.99;枪头插紧,避免有气泡。配样品时要注意弹匀每个组分。2.跑胶过程中,如果移液器无法锁定量程的话,要看一下每一枪加的是否一样。3.选择一个适合自己
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问
转膜的时候怎么判断有没有把目的蛋白转移到膜上?
未来9
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准,通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春 红染色液对膜进行染色,以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色,以观察蛋 白的残留情况。
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问
WB条带每次曝光的时候条带边缘都有黑色的一圈是什么原因?
dxy_gwrp7ndq
第一 建议用5%脱脂奶粉封闭,有条件的话封闭过夜,室温下至少封闭1小时。第二 你 一抗二抗 稀释液应该都用 含脱脂奶粉的来配,这样可以降低背景。第三 这种现象我也遇到过,很可能是你一抗或二抗刚刚稀释之后,没有混均匀,然后就把膜放下去了。有的时候局部浓度特别大的时候,会造成严重的非特异性结合。第四 洗膜不需要洗那么长时间的。一般洗3次,每次6~7分钟就可以了。敷完二抗之后洗3次,每次10分钟,
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问
在样本制备和加样的过程中,所有会影响蛋白上样量的可能因素有哪些?如何提高蛋白上样量?
未来9
1、影响因素:样品浓度,蛋白裂解是否完全2、可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30%是不会有问题的,建议尽量不超载加样。如果已经超了不少了,而且小分子量的也要,可以考虑加大胶的厚度,以增大上样孔体积,可以试1.5mm厚的胶。
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问
如何利用血小板提取液检测血小板EP3受体
bamboopiggy
买ep3受体的抗体,直接western blot检测呗,如果少,就用elisa检测。
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问
蛋白纯化有杂质怎么办?
bamboopiggy
可以在上柱前,多离心几次,去掉杂质,如果是杂带的话,就挂柱以后,多洗几次。
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问
求助:wb蛋白条带位置不对
bamboopiggy
你看一下cst说明书里,wb的条带在哪里,其实你只要跑过全膜,确定了你的位置,即使位置和预测的不一样,也是可以的,就是你的这个位置有点寸,咋感觉是你的lysis没有打开到一级结构,还是二聚体的感觉。因为40-50,70-100正好是二倍的感觉
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问
请问一下P3出现阴性一般什么情况下会出现?
bamboopiggy
你说的是阳性对照出现阴性?那别的呢?如果都是阴性,可能是抗体不好使了,或者是浓度不够。
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问
P65和它的磷酸化问题
bamboopiggy
total的蛋白和磷酸化的一个趋势,这个是很常见的,你可以和内参比,只要p65磷酸化了,就是说明起作用了。
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问
请问这块胶是什么问题啊,分离胶没凝好吗?
智明在寻找春娇的路上一去不复返
看marker的话整个胶应该没问题。可能是上样量比较多 用ripa稀释下看看?
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问
样品中有无机杂质影响蛋白含量测定,有什么办法能降低干扰?
bamboopiggy
蛋白质的测定方法有好多,如:凯氏定氮法,双缩脲法,folin-酚法,考马斯亮蓝法,等等,你可以找一种与你的无机杂质不反应的方法来测。
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问
提取鱼类肠道微生物,用来做16s测序,有哪些好的方法?
bamboopiggy
找一个靠谱的公司比什么都重要,尤其是做过鱼类16s的,否则什么样的bug都会给你弄出来。甚至会测不到。
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问
western blot 内参
Y_沙琪玛
可能你用的内参是多抗而不是单抗的原因
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问
杂同一个蛋白的兔抗和鼠抗为啥结果不同?
迟C迟
首先,兔抗血清通常含有高亲合力抗体,可以比鼠抗血清识别更多种类的表位。其次,兔单克隆抗体能够以识别许多在小鼠中不产生免疫的抗原。
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问
为什么marker分子跑不到15KD?
whilt-shirt
15KD的分子建议用12%的胶,10%的胶跑不了15Kd
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问
阴性对照组没有染色,但是组织切片和阳性对照却呈弱阳性?
Y_沙琪玛
1.阴性对照在洗片过程中被污染。2.染色体浓度太高。3.染色剂清洗不彻底。
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问
蛋白质浓度测量不准时,如何保证western blot上样量?
whilt-shirt
先根据BCA结果上一次,再根据第一次实验结果通过校准内参来调节上样量
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