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问
求载体构建的完整步骤和需要注意的事项哇
dxy_gwrp7ndq
载体构建的注意事项:1.连接反应是 DNA 重组过程中的关键步骤,其成败的重要参数之一就是温度,因此要控制好连接温度。2.进行黏末端连接时,会产生一定数量的载体自身环化分子,导致转化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一问题,常采用牛小肠碱性磷酸酶( CIP )去掉载体的5’﹣磷酸以抑制 DNA 片段的自身环化。
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问
asc寡聚化实验总是有问题😭
bamboopiggy
将沉淀重悬于 50 μl CHAPS 缓冲液中,其中含有 4 mM 辛二酸二琥珀酰亚胺(溶解在 DMSO 中)。在室温下孵育 30 分钟以交联蛋白质。在 4 °C 下以 5,000 x g 离心 8 分钟,弃去上清液并将沉淀重悬于 30 μl 的 2x 蛋白上样缓冲液中。在 95°C 下加热样品 2 分钟。应该就可以
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问
蛋白条带的问题求助,各种有问题的条带
喵喵喵柏
不知道你具体的问题是什么第一张图的右下角你应该是有一个气泡,所以条带上面有一个小白点如果你的问题是他不是单个的条带,有很多条带的话,需要看一下你的抗体是不是多克隆的剩下的几个你可以调整一下,把背景跟条带的对比度调的大一点最后两张膜你应该是发光的时候折了一下膜,膜上有折痕就会出现这种印记
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问
免疫荧光一抗没在摇床上过夜,就只在四度静置过夜会染不上吗?
dxy_gwrp7ndq
不保证能均匀敷上,效果会不好。
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问
qRT-PCR结果中复孔的cq值相差多少不可用?
cxsm
对于含量较高的基因来说,个人认为能接受0.5以内的差值吧,一般32个循环以后的基因,基本可以不用考虑了,除非处理之后有极大的变化,CQ值变小到30以内就0.5以内还可信,CQ变大了,最多1吧,放弃吧别考虑了
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问
用trizol提取总RNA时,在加入氯仿前的步骤都可以放在置于冰上的板子室温静置么?组织加入裂解液后室温放置与插入冰块中有区别么
府宅
上样前加入裂解液,室温放置30 分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,其余步骤在冰上操作
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问
流式检测未经处理的肿瘤细胞的钙网格蛋白的水平,为什么本地就很高
府宅
推荐染色时添加FcR block,加去死细胞染料另外阴性对照用同型抗体
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问
碧云天核蛋白提取试剂盒提取后为什么跑wbnrf2蛋白无条单laminb也没有?
bamboopiggy
1.你跑whol lysit的对照了么?对照有条带吗?2.这俩抗体你以前用过吗?切的位置对不?二抗有没有用错?现在提核的技术很稳定,碧云天的盒子应该可以用,不行的话,你买个thermo的盒子试试。那个我用过,没问题的
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问
求问,我做的ROC曲线联合指标的面积比不上单个指标的面积,啥情况呢?我做的对不对啊,求大佬帮帮我说两句原因,我是个小白
bamboopiggy
如果单纯看你的说法,就是你的联合治疗,不如单药治疗,你首先看你下,你两个单药治疗的ROC曲线下面积是不是都大于0.5,如果都大于0.5,那没有办法了,如果其中一个小于0.5,你可以把这个结果翻转一下,再联合分析。
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问
双酶切产物OD值过高可能是什么原因?
bamboopiggy
胶回收的260,280没法看的,只是能给你提供参考浓度,算你的插入片段和backbone的比例。
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问
20220412分光光度计培训 提问
bamboopiggy
是的,是仪器自动把光程归一化为1cm了。光程归一化为1cm后,则吸光值A为1时,相当于dsDNA浓度约为50ng/μL、或ssDNA浓度约为33ng/μL、或RNA浓度约为40ng/μL。由此,可根据吸光度估算核酸的浓度,这种计算在许多仪器中可自动进行。
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问
wb条带特别细是什么原因?tlr4 肠蛋白1:1000
dxy_gwrp7ndq
你的问题是没有选对合适浓度的胶,一般使用的胶浓度为6%,8%,10%,12%和15%的胶,而不同浓度的胶对蛋白和指示剂的压缩效果不同,浓度越高,压缩的效果越好,指示剂和显影得到的目的蛋白的条带就越细;而胶的浓度越低,指示剂和蛋白就能跑的越分散,看起来就相对粗一点。
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双酶切怎么也没切完全,有假阳性怎么办?
bamboopiggy
你先看看你的酶切的接口会不会自连,然后可以做单酶切的对照,是否都可以同时切成线性。
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荧光定量PCR不制备重组质粒可以做吗?质粒可以
bamboopiggy
可以做啊,只要你有cdna片段就可以,或者是dna片段,也可以。
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求助6.12.24孔板细胞铺板密度,有大佬能给4倍镜下的照片参考一下吗?
dxy_gwrp7ndq
一般最适浓度为5~10×105细胞/ml。如一般10cm皿的细胞约300-500万个,一些细胞个体小也能达到1000-2000万,可根据所需细胞数目取出部分作稀释或连续稀释后计数。
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问
蛋白总是发成这样,为啥呢?
bqejjh123
可能是因为你的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的杂质含量太高了
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问
wb条带整个泳道都是黑的
bqejjh123
可能:1.凝胶不均匀冷却,中间冷却不好; 电泳系统温度偏高,这样容易形成混乱一片。2.可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全,也容易混乱。3.样品溶解不好。4.样品中含有不溶性颗粒。5.加样量过多。
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问
动物病料病毒分离分离中,如何只保证不含其他野毒感染,只分离目的病毒
bamboopiggy
病毒分离 取动物病理组织样品,分别制成100 g/L的 组织悬液,加青霉素(100 Iu/mL)、链霉素(100 pg/mL),4℃ 3000 r/min离心20 min,取上清液接种于Dulac细胞;接种后 6 h用300 mm01/L n葡糖胺(口glucosamine)37℃处理30 min。再培养72—96 h,将增殖病毒的细胞反复冻融3次,收集 细胞病毒液。用细胞病毒液再接种细胞,共传代
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问
从细胞中提取出的线粒体如何计数?
天一湖医者
不同种类的试剂盒提取的都不同。一般产品包装盒中都附有说明书的。小量质粒提取试剂盒 100-500ng/uL;一般能有300ng/uL
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细胞复苏之后不贴壁
biu2266
复苏血清浓度要提高,细胞密度最好增加
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