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问
PCR实验什么情况下需要使用RNase H?
丁香清香
RNase H可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。当PCR实验RNA/DNA杂合体不能正常水解时,需要考虑使用
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问
用cDNA扩增一个基因,总是扩增出带有内含子的片段 ,怎么办
丁香清香
1. 任何一个时刻,提取的RNA里有尚未完全加工成熟的mRNA.2. 不管是否去除gDNA污染,都无法改变事实。只有靠marker去寻找正确长度的片段克隆,才能有可能得到不含内含子的基因片段。3. 注意灯下黑,如果测序引物位点离正向引物太短,正向引物可能不完整或有模糊碱基。
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问
克隆较长片段的基因组DNA的时候,怎么检测模板DNA是否合格?提DNA的时候有什么需要注意的地方?用什么方法提?
Eason老歌迷
提dna需要注意的点,比如说,你在操作时一定要轻柔,动作要缓和,避免剧烈运动
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问
小提质粒的产物始终很低,可能是什么原因?
Keven轩
可以试试热洗脱冷结合,最后一步离心除去乙醇之后在60度金属浴上烘干5min让乙醇充分挥发,同时减少洗脱液的量
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问
怎么保存酚不被空气氧化?
小露娜i
加入巯基乙醇和8-羟基喹啉至终浓度为0.1%。8-羟基喹啉是带有淡黄色的固体粉末,不仅能抗氧化,并在一定程度上能抑制Dnase的活性。用Tris PH8.0水溶液饱和后的酚,最好分装在棕色小试剂瓶里,上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液,隔绝空气,也可以往瓶里充入氮气,防止与空气接触而被氧化。然后保存在4℃或-20℃冰箱中,可以保存几个月不会变色。
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问
基因组DNA提取使用试剂盒如何避免污染?
未来9
所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染,试剂避免受到微生物的污染,因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。如果样品不立即使用,应将其分成小部分-70℃保存,避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒,检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本/标准品,酶结合物或底物时
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问
呈粉红色的酚可以使用吗?
bamboopiggy
不能用了,苯酚暴露在空气中被氧气氧化为醌而呈粉红色。所以还是再买一瓶吧
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问
为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戌醇?
dxy_9n80neqq
在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡容光焕发器数次,加入异戌醇能降低分子表面张力,减少在振荡时气泡的产生;配比一般是氯仿与异戌醇为24:1,也可以采用酚,抽提DNA去除蛋白质时,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时,将酚与氯仿混合(1:1)使用
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问
如何才能去提高DNA的提取率?
bamboopiggy
减少洗脱体积,增加洗脱次数。再就是裂解细胞要严格按照protocol来,别裂解过了,也别裂解的不够。
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问
为什么在保存或抽提DNA过程中,一般采用TE缓冲液?
bamboopiggy
TE缓冲液是弱碱性,对DNA的碱基有保护性,(DNA在TE中的稳定性较好,不易被破坏其完整性或产生开环及断裂),包括提取好的DNA也要放在TE缓冲液中保存.
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问
提取RNA前,发现Buffer GTC有沉淀物,怎么办?
天一湖医者
如果在加入异丙醇之后就有沉淀,这肯定是蛋白质。也可能是无机盐沉淀,什么碳酸钙之类的 因为,不溶于水,又不溶于75%的乙醇。
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问
测序结果中有时候为什么找不到引物序列?
Eason老歌迷
用PCR引物作为测序引物进行测序时,所测序列是从引物3'末端后第一个碱基开始的,所以自然就找不到您的引物序列了。有两种方法可以得到您的引物序列。对于较短的PCR产物(<600bp),可以用另一端的引物进行测序,从另一端测序可以一直测到序列的末端,就可以在序列的末端得到您的引物的反向互补序列。对于较长的序列,一个测序反应测不到头,因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中,用载体上的通用
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问
为什么需要使用无水乙醇来沉淀DNA?用95%乙醇可以吗?
bamboopiggy
原因:1.DNA不溶于乙醇2.乙醇可以吸附水分子(极性相同),使得溶液中相对的水分子减少,增大了DNA在水中的相对浓度.3.附:乙醇沉淀DNA需要盐离子,用金属离子屏蔽DNA上磷酸的负电荷,降低DNA分子间的斥力,才能沉淀完全.可以用95%的,就是会增大液体的体积
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问
质粒构建整个流程和软件
juyue2010
snapgene软件不错,简单易学,功能齐全
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问
为什么有时DNA提取量比较少?有没什么办法解决?
Keven轩
用个质量比较好的进口试剂盒就行
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问
瞬转和稳转,提的DNA有区别吗?
Keven轩
提的DNA经PCR及琼脂糖凝胶电泳后没区别,都有目的基因的阳性条带。一般像构建细胞系用稳转,想快速获得大量目的基因表达产物用瞬转
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问
求助HepG2细胞培养基背景里面黑点及条状物是什么啊,有没有什么办法去除😭
bamboopiggy
这些小黑点是细胞自己分泌的,因为hepG2 有点挑血清,血清不好,它就会分泌一些物质,状态就稍微差点。
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问
求各位大神解答?我的质粒浓度240纳克每微升,酶切后线性化载体条带就很弱 ,目的条带200bp直接看不到,这怎么解决呢?
n0y0j7
为什么要切这个?连之前不用看小的,大的切完全就行了。连之后筛选阳的直接测序啊
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问
养的DC细胞不贴壁,还有cd14+?
bamboopiggy
在第0天,对来源于一个白细胞单采术样本的细胞进 行铺板,挑选贴壁2小时的单核细胞。将没有贴壁的 细胞冲洗掉,贴壁的细胞在培养基中培养7天。在第5 天,将成熟化添加物分别加入到细胞(成熟的树突状 细胞)或者不加入到细胞(未成熟的树突状细胞)中 培养两天。通过流式细胞仪来测定未成熟及成熟的 树突状细胞中CD80、CD83和CD86的表达。在第7 天,细胞表达了成熟的树突状细胞标志物CD80、 CD83
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问
5000多bp的载体和5000多bp的目的片段连接体系?
天一湖医者
一般情况下载体与片段的摩尔比建议为1:3。
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