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问
为什么产生了非特异性条带?
天一湖医者
1.抗体浓度过高;降低一抗、二抗的浓度,可以分梯度进行。2.一抗的特异性不足;使用单克隆抗体,单克隆位点的抗原表位是唯一的,多克隆位点的表位不唯一。3.二抗的非特异性结合,不加一抗,其他操作不变,即可检测出二抗的非特异性的条带是否来自二抗的非特异性结合;此时需要重新选择二抗。4.样品蛋白质上样量过大;降低上样量,可以分梯度进行。
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问
为什么我的扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅?
bamboopiggy
是所有的都这样么?会不会是1.你胶漏了,2,你的引物不特意,没有得到特异性的pcr产物。
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问
外泌体提取rna后,检测内参不齐,需要引入外参吗?
bamboopiggy
可以引入外参,但是要满足以下条件:1. 与待检的目的RNA在样本中具有一样的存在形式,即囊泡包裹状态存在;2. 在外泌体分离富集过程中与待检外泌体RNA具有一样的动力学行为;3. 在外泌体RNA提取及PCR检测过程中具有一样的效率。也即可以完整的模拟目的基因在整个液体活检过程中的动力学变化。
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问
基因扩增时候以cDNA为模板,为何扩增出一片弥散的带?
dxywode
我也是用cDNA做模板的,没有出现过弥散带的情况,但经常出现非特异性条带。出现弥散带的原因可能是你在做凝胶电泳时电泳液被污染或者是做的胶有问题,也可能是你的cDNA部分降解了,至于降解的原因主要是由于时间和温度。扩增完的东西要立即进行电泳,其次电泳的室温不宜太高时间不要太长,一般最多半个小时左右。另外在扩增过程中,由于气候的缘故,部分PCR仪在室温超过30度后就不能正常工作了,这要看PCR仪的型号
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问
请问各位大佬,本人构建了x-pET28a的质粒,转到了C43感受态里,在37℃摇起来了,结果加完诱导剂28℃越摇越澄清什么情况?
天一湖医者
.1工程菌的问题,可能携带的质粒已经丢失,工程菌不具有抗性,建议在诱导前先检测一下质粒稳定性.2.活化诱导时加入的抗生素过低未加或失效,扩大培养时加入抗生素又过量,建议重新配制抗生素.3.加入的IPTG浓度过高.4.培养基的问题,营养不足.
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问
在用无水乙醇沉淀DNA时,为什么一定要加NaAC或NaCL至最终浓度达0.1-0.25MOL/L?
bamboopiggy
乙醇沉淀DNA需要盐离子,用金属离子屏蔽DNA上磷酸的负电荷,降低DNA分子间的斥力,才能沉淀完全.所以需要加NaAC或NaCL
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问
为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?
bamboopiggy
一、水饱和酚又叫水平衡酚。水饱和酚的PH小于7,一般是PH为5.0左右,通常与异硫氢酸胍一起使用,用于细胞RNA的提取,在酸性环境中,DNA在酚相,RNA在水相。两者就分开了。二、Tris饱和酚一般PH大于7.8,用于DNA的提取。其中,酚是强的蛋白变性剂,可以使细胞或组织中的蛋白质变性析出。 而Tris的主要作用是防治止酚类氧化,若酚类氧化,则会形成醌(两个苯环),醌含有强自由基,会破坏核酸结构
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问
如果最有效的提高DNA提取的纯度?
bamboopiggy
1.细胞充分裂解 2 沉淀DNA时加足量甚至过量的异丙醇,3 ,用rna酶处理,去掉其中的rna。 4,晾干过程要充分。
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问
为什么不能用质粒DNA来提取基因组DNA?
未来9
基因组DNA的抽提,一般不会用到质粒抽提的试剂盒,原因是由于两者的原理完全不同
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问
DNA纯化的目的是什么?
未来9
目的是回收 得到纯的目的DNA片段,去除影响DNA连接酶活 性的物质以及其它的DNA片段
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问
基因组DNA提取使用试剂盒如何避免污染?
未来9
所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染,试剂避免受到微生物的污染,因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。如果样品不立即使用,应将其分成小部分-70℃保存,避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒,检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本/标准品,酶结合物或底物时
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问
DNA测序数据可视化,可以使用哪些软件
未来9
目前常见的基因组可视化工具有Circos软件、Integrative Genomics Viewer(IGV)、GBrowse等
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问
呈粉红色的酚可以使用吗?
bamboopiggy
不能用了,苯酚暴露在空气中被氧气氧化为醌而呈粉红色。所以还是再买一瓶吧
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问
如何才能去提高DNA的提取率?
bamboopiggy
减少洗脱体积,增加洗脱次数。再就是裂解细胞要严格按照protocol来,别裂解过了,也别裂解的不够。
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问
DNA提取洗脱体积太小,50ul会有什么影响?
Keven轩
回收的DNA浓度会比较高,但是量不多
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问
荧光定量PCR内参没有结果的原因?
dxywode
先做普通PCR,电泳检测,看看目的条带好不好,好的话,再做qPCR,普通PCR做好了,qPCR的结果自然好。
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问
在保存或抽提DNA过程中,需要哪种缓冲液? 如果需要,哪种缓冲液比较好?
Keven轩
一般是用1X PBS磷酸盐缓冲液
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问
吲哚美辛腹腔注射试剂怎么制备
dxywode
本试验处方中以二甲基甲酰胺和注射用水作为混合溶媒,提高吲哚美辛的溶解度,乙醇胺调节PH值,进一步增大吲哚美辛溶解度,乳酸调节pH值减少刺激性。吲哚美辛易溶于二甲基甲酰胺,但当加入等体积注射用水后吲哚美辛易析出。此外pH值的变化也能影响吲哚美辛的溶解。因此本处方中的影响因素主要有吲哚美辛的投药量,二甲基甲酰胺用量,乙醇胺用量及pH值的大小,根据主要影响因素设计如下的三个处方,通过观察是否有药物析出以
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问
感染细胞不同时间点收样,怎么确定什么时候收样?
dxywode
转染的质粒和promoter不同,细胞表达的时间也不尽相同。 一般在24-48小时之间。你第一次做的话,就勤快点常观察。
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问
请问植物原生质体制备和培养过程中维持细胞渗透压的除了甘露醇还可以用什么物质?
bamboopiggy
山梨糖醇和海藻糖也可以,但是看文献,还是用甘露醇的多。
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