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问
没有CT值出现,可能原因有哪些?
天一湖医者
反应循环数不够 一般都要在35个循环以上,可根据实验情况增加循环(如至45循环), 但高于45个循环会增加过多的背景信号检测荧光信号的步骤有误 一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号引物或探针降解 可通过PAGE电泳检测其完整性模板量不足 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的zui高浓度做起模板降解 避免样品制备中杂质的引入及
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问
换新的一管酶,做实时荧光定量复合扩增的HRM曲线总是发现内参跑的不好,峰很低是怎么回事?
bamboopiggy
是不是你内参的引物用的时间比较久坏了?
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问
qPCR实验重复性问题
天一湖医者
是的,首先qPCR不是很准,特别是对于新手来说。其次,三个平行以上才具有统计学意义,三个生物学重复以上才具有生物学意义。(发表文章时需要)最好能够设置3个复孔,同样的实验再重复3次以上才有可信度.不同的孔之间的差异不要大于0.4-0.5为有效,否则肯定是加样过程出了问题.
4 回答
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问
荧光定量PCR反应预变性的目的是啥?
bamboopiggy
为了使dna双链更好的打开,跟primer结合
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问
荧光定量PCR反应体系
bamboopiggy
500ngrna反转后,稀释到200ul,取4ul上样
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问
pcr扩增曲线有异常,总出现s型曲线
bamboopiggy
检查是不是都是在同一个孔,可能是这个孔被污染了,或者是热板盖歪了
3 回答
998 围观
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问
跑pcr,怎么避免非特异性条带
bamboopiggy
注意annealing temperature,可以适当提高
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问
PCR的产物总是太少,是什么原因?
bamboopiggy
看看你是不是酶啊,引物啊,或者是模版加的浓度不对
4 回答
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问
pcr引物可不可以mix之后保存?
bamboopiggy
可以将pcr引物稀释后,按照1:1的浓度mix保存
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问
提取细菌RNA需要去除基因组DNA吗?
bamboopiggy
需要去除基因组DNA,否则对实验结果有影响。
7 回答
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问
验证质粒是否导入感受态是应该做pcr电泳还是直接做测序好呢?
bamboopiggy
都可以,一般会选择pcr鉴定,但是现在有些实验室有钱。就直接送测序
4 回答
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问
洗涤RNA沉淀倒上清时候,倒不干净,我可以用枪头吸吗?
Junego
可以,少量残留液用干净小枪头吸,不同样品之间记得换枪头。
6 回答
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问
自己引物设计软件和文献报道不一样
bamboopiggy
只要引物好用,不用管是不是和文献报道的一样,只管用
6 回答
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问
rtPCR引物长度336bp可以用作引物吗?
bamboopiggy
可以用作rtPCR的引物,因为你已经找不到更合适的了,产物稍微长一点也是可以的。注意一下你的延伸时间就好
4 回答
660 围观
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问
引物设计提示多条合适,如何从中选择最优的
bamboopiggy
不用,你可以选比较靠前的引物,产物长度在50-200bp左右u
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827 围观
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问
如何选择多重荧光定量pcr的报告基团和淬灭基团,选择原则是什么?淬灭基团是不是一样比较好?
天一湖医者
根据荧光定量PCR仪荧光通道,选择适配的荧光基团,优先选择常用的荧光基团,如FAM、VIC或CY5等;2. 根据荧光基团类型选择淬灭基团。早期的淬灭基团TAMRA,自身会发出荧光信号,干扰检测结果,后续慢慢地被其他淬灭基团替代。目前淬灭基团最常用的就是BHQ、NFQ-MGB或QSY等;3. 进行多重qPCR检测时,每个通道要选择不同的荧光基团,且避免各标记基团的激发和发射波长重叠,出现荧光干扰的情
3 回答
7735 围观
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问
RTPCR实验高浓度的cDNA会对最终结果造成影响么?
bamboopiggy
模版浓度太高,可能与引物结合不完全,也可能很早就达平台期,看不出差别。一般要求酶和引物是过量的
7 回答
1885 围观
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问
求助,半定量PCR的问题
bamboopiggy
半定量PCR是首先通过确定目标物PCR有限扩增至最大值的最低循环数,进而比较不同样品之间该目标物的PCR扩增产物数量,以此确定样品中目标物的相对数量。也就是说是一个相对值,不是绝对含量。至于第二个问题,完全一样的操作,并不代表完全一样的模版都加进去了,每加一次样,都可能存在误差,甚至没有吸到液体。
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问
PCR程序设定是根据什么来的?
shanshan2113
pcr程序设定取决于:1.扩增酶的类型,决定变性温度,扩增效率等;2.扩增引物,决定退火温度;3.目的片段大小,决定延伸时间。
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问
定下引物的Tm值范围之后即可定下引物的长度范围吗?
shanshan2113
引物Tm值与引物序列GC含量有关,确定Tm值后,若GC含量高,则引物短,GC含量低,则引物长。
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