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        pcr扩增曲线有异常,总出现s型曲线

        相关实验:逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR,rtpcr)

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        Eason老歌迷

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        3 个回答

        user-title

        bamboopiggy

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        检查是不是都是在同一个孔,可能是这个孔被污染了,或者是热板盖歪了

        user-title

        未来9

        有帮助

        原因很多:反应体系引起的扩增曲线不光滑---扩增效率偏差(过高或过低)

        A. 扩增效率过高

        出现非特异扩增或引物二聚体:反应体系内模板浓度太高以及模板核酸质量较差,可能导致出现抑制 PCR 反应的现象。在绝对定量时表现扩增效率大于110%。

        B. 扩增效率过低

        扩增效率过低主要表现在试剂浓度不适(主要是引物、镁和 Taq DNA 聚合酶,尤其是在多重实验中),引物对Tm之间的差异超过5°C以及热循环条件不适,试管中各种同源物质的竞争作用可造成反应效率低下。绝对定量表现:扩增效率<90%。

        C. 个别扩增曲线异常

        如个别扩增曲线突然骤降:反应管内留有气泡,由于温度升高后气泡破裂,使仪器检测到的荧光值突然降低所致。进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

        仪器设置不当引起的曲线异常:基线设置不当,如扩增曲线断裂或下滑:基线的终点值大于 Ct 值。减小基线终点 (Ct 值- 4),重新分析数据。

        Rox 添加不当:表现为扩增曲线呈锯齿状且不连续,需校正参比染料

        user-title

        天一湖医者

        有帮助

        有可能是以下环节存在问题:

        1、模板的浓度太高或者降解。

        2、荧光染料的降解。

        3、在操作荧光定量 PCR 时,带上新的一次性手套,盖上避免任何指纹或者字迹等。

        4、液体挥发。耗材气密性等问题引起液体蒸发,没有很好的聚集在管子里;

        5、气泡。操作问题如移液枪加样引起的气泡问题。

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