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        RTPCR实验高浓度的cDNA会对最终结果造成影响么?

        相关实验:实时荧光定量 PCR(realtime PCR)

        user-title

        未来9

        组织中提取RNA 检测纯度后稀释到2-3μg/μl, 直接用1μl+6μl水制成CDNA 后real-time PCR 内参和样品检测,对结果有影响么?

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        7 个回答

        user-title

        bamboopiggy

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        模版浓度太高,可能与引物结合不完全,也可能很早就达平台期,看不出差别。一般要求酶和引物是过量的

        user-title

        迟C迟

        有帮助

        RNA纯度浓度越高,逆转录得到的cDNA模板质量就越高,1微升用6微升水稀释逆转录应该问题不大,看下管家基因Ct值,在15-20之间数据即可,如果起峰太早,可再稀释一下。

        user-title

        汤姆卜丽波

        有帮助

        应该不会有影响,趋势是一致的,你看下这篇文章

        https://www.yeasen.com/news/detail/537

        user-title

        balalaLy

        有帮助

        2-3ug的RNA有点高了,但也能跑,逆转录成cDNA后稀释倍数高一点也可以。

        user-title

        天一湖医者

        有帮助

        RTPCR实验高浓度的cDNA会对最终结果造成影响。一般试剂说明都有推荐浓度的。最好按试剂说明选取适当的浓度。

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        丁香清香

        有帮助

        因为rtPCR十分灵敏,你调整了RNA浓度后,internal control的CT和目的基因的CT应该都会有所变化。但是,如果你的操作没问题,理想情况下其之间的比值应该是不变的。

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        Eason老歌迷

        有帮助

        建议还是按照标准操作步骤操作吧。1.提取组织RNA时,每50~100mg组织⽤1ml Trizol试剂对组织进⾏裂解;提取细胞RNA时,先离⼼沉淀细胞,每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后,反复⽤枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞;2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转⼊EP管中,在室温15~30C下放臵5分钟;3.在上述EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加⼊氯仿,盖上EP管盖⼦,在⼿中⽤⼒震荡15秒,在室温下(15℃~30℃)放臵2~3分钟后,12000g(2℃~8℃)离⼼15分钟;4.取上层⽔相臵于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加⼊异丙醇,在室温下(15℃~30℃)放臵10分钟,12000g(2℃~8℃)离⼼10分钟;5.弃上清,按照每1ml TRIZOL加1ml 75%⼄醇进⾏洗涤,涡旋混合,7500g(2℃~8℃)离⼼5分钟,弃上清;6.让沉淀的RNA在室温下⾃然⼲燥;7.⽤Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

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