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问
pcr扩增中出现的非特异性条带
Eason老歌迷
一般出现非特异性条带,我们可以用下面的办法解决,降低引物和聚合酶的用量,提高退火温度,或者是采用梯度PCR法,测试能够获得最佳结果的温度退火。如果还是不行,就试试touchdown方法,退火温度从高到低,每隔一个反应温度下降1C或者怎么样的,这样可以便于扩增出特异性更好的条带。当然,如果模板可以纯化一下,或者重新制备,也可以避免有非特异物质或者是降解的片段干扰。总之就是先优化。实在不行需要重新设计
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问
18T质粒测序结果比对不上
天一湖医者
1、测序结果比对时候,选用反向互补;如果依旧不对,2、可能是没连上去,因为PCR能扩出条带,不一定就是你目标条带,PCR不严格,不能完全说明问题。此种情况,建议,挑选多个单克隆,进行PCR,挑选最亮的且条带大小一致的送去测序。
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问
PCR技术如何应用于亲子鉴定?
Eason老歌迷
利用PCR技术合成的DNA进行亲自鉴定,其原理是:首先获取被测试者的DNA,并进行PCR扩增,取其中一样本DNA用限制性内切酶切成特定的小片段,放进凝胶内,用电泳推动DNA小片段分离,再使用特别的“探针”去寻找基因。相同的基因会凝聚在一起,然后利用特别的染料在X光下,便会显示与DNA探针凝聚于一起的黑色条码,每个人的条码一半与其母亲的条码吻合,另一半与其父亲的条码吻合。
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问
有关pcr mapping分析基因环境结构的问题
Eason老歌迷
引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp。引物GC含量一般为40%-60%, 45-55%为宜。引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间。可以用ncbi查,然后用Primer Premier设计
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问
huh7 细胞培养时应该注意些什么啊?我每次复苏传3-4代就开始状态不好。
balalaLy
新复苏后每次传代传密一点,太疏了长不好。刚开始那几天可以勤一点换液。
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问
是否可以对入噬菌体直接进行LA PCR反应?
未来9
可以的,可以直接对菌体直接进行LA PCR反应
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问
PCR的循环数可以超过35吗?
未来9
一般不超过35次。随着反应时长加长,会导致非特异性产物相应增加产生干扰;另外设计实验的时候减少循环次数可以减少使用量缩短时间。
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问
PCR实验的酶该怎么选择?
未来9
根据考虑的指标,如特异性、灵敏度、扩增片段长度、能否进行复杂模板扩增以及优化条件难易等等,我们将主要的Taq酶归归类,其性质、用途也就一目了然了。
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问
qPCR试剂盒放了一年还能用么?
未来9
可以的。荧光定量PCR试剂盒保存条件: 收到本产品后,请立即置于-20℃避光保存,一年有效。
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问
RT-PCR的数据处理方法如何选择?
未来9
常用的相对定量数据分析方法有双标曲线法, ΔCt法, 2-ΔΔCt法(Livak法),用参照基因的ΔCt法和Pfaffl法。对比如下图:
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问
乳液PCR有了解的么?
汤姆卜丽波
有专用的孔隙大,低吸附的枪头,用那种试试
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问
NEAT1基因有两个转录本,长的转录本是在短的转录本基础上的延长,这种情况下怎么设计针对短转录本的特异引物?
Eason老歌迷
NEAT1基因其实有两个转录本:NEAT1_1和NEAT1_2, NEAT1_1(3.7 kb in humans, 3 kb in mice)与NEAT1_2 (23 kb In humans, 20 kb in mice)的5’末端完全重合,两个转录本均只包含一个外显子,而且均留在核内。NEAT1_1多聚腺苷化,类似于mRNA,而NEAT1_2对paraspeckles至关重要,构成其“arc
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问
单链DNA可不可以qpcr,空白对照CT值很高是否异常
bamboopiggy
pcr的原理就是要双链DNA,所以不管是pcr还是qpcr需要的模板都是双链DNA。 空白对照CT值高,可能是引物不特异,形成了引物二聚体。
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问
什么方法可以降低引物二聚体?
balalaLy
降低引物浓度减少循环次数减少模板用量
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问
内标法和外标法哪种数据更精密?
汤姆卜丽波
如果应用外标法能够满足要求的话,当然首选还是外标法,毕竟简单而省事。对于精密度要求比较高、结果准确度会产生重大影响、实验室条件不是很理想的等等条件下,用内标法还是必要的。
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问
求助:摇好的菌离心收集后可以放-20度冰箱,过几天再超声裂解菌体提蛋白吗
汤姆卜丽波
我们这样做过,最好是放-80,
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问
探针法多重PCR,扩增时,各条探针平台期荧光信号强度相差大,有必要使信号强度一致吗?
Eason老歌迷
并不需要!但是如果你以后想荧光信号差不多一致的话,可以注意下面的几个点:确保加样的准确性,确保移液的精准度,体系混匀并进行离心,qPCR试剂的选择:选择“预混液”形式的qPCR试剂,反应体系只需加入引物和模板,大大简化实验的操作步骤,减少了加样误差。
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问
模版非常低,反转录时,扩增长片段5K左右,使用oligo dT,还是特异性引物,更容易扩增出来?
未来9
一般情况简单地说你的目的mRNA有playA尾,且基因较小2000bp以内吧都可以选择oligo dT;基因特异性引物适用于与模板序列互补的引物,适用于目的序列已知的情况.。
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问
模板浓度,引物浓度如何摸索?
天一湖医者
常用浓度是10uM/L也就是10pM/L.这样的话,20ul体系加1ul,50ul体系加2ul。
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问
请问酵母单杂自激活确定抑制剂浓度之后,在点对点验证中目的基因启动子和AD空载组合还会长斑点吗?
天一湖医者
酵母单杂自激活确定抑制剂浓度之后,在点对点验证中目的基因启动子和AD空载组合会长斑点。
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